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jamy1989木蟲 (小有名氣)
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[求助]
透析后蛋白沉淀
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我的目的蛋白在用8M尿素溶解后透析復性，透析完后全部沉淀了，跑膠什么都沒有！我透析的步驟是： 1、4M尿素 0.1M Tris-Hcl 0.4M L-Arg 1mM EDTA 0.2mM PMSF 5%甘油 PH=8 2、1M尿素 0.1M Tris-Hcl 0.4M L-Arg 1mM EDTA 0.2mM PMSF 5%甘油 PH=8 3、binding buffer 20mM磷酸鈉 500mM氯化鈉 5mM咪唑 PH=7.6 各位看看問題出在哪里呢？我每步在4度冰箱透析了24個小時！是不是我的蛋白濃度太大了呢？還是我透析的步驟太少！？或者其它什么原因？急呀？？？ |
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jamy1989: 回帖置頂 2012-04-29 09:29:11
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這次透析的蛋白溶度被我降低了！并且每升只透析20ml，我做了個對比試驗： 1號瓶分別用4M 尿素、 1M尿素、binding buffer 透析！ 2號瓶分別用4M 尿素、 2M尿素、1M尿素、0M尿素、binding buffer 透析！ 結果1號瓶還是在用binding buffer透析是全部出現(xiàn)沉淀，取沉淀跑膠，能看到目的條帶！ 2號瓶也是在用binding buffer 透析是全部出現(xiàn)沉淀（大約在透析3個小時的時候就有很多沉淀了），和1號瓶一樣！另外當2號瓶透析到0M結束時我取了一些樣保留下來，跑膠能看到目的條帶！ 我在想是不是binding buffer 有問題呢？我底下準備用His-tag純化蛋白，是不是一定要用binding buffer 透析呢？ |
15樓2012-04-29 09:28:23
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