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制作超級電轉(zhuǎn)感受態(tài)注意事項 已有6人參與
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Q高效率感受態(tài)細胞的制備注意要點 2010-05-20 22:04 來源：互聯(lián)網(wǎng) 點擊次數(shù)： 1034 關鍵詞： 感受態(tài)細胞 制備 現(xiàn)在大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率最高的要數(shù)電轉(zhuǎn)化，可達到1010，但是操作起來比較麻煩。要想又簡單，又能有較高的轉(zhuǎn)化效率，最好的莫過于1990年《Gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化方法。 根據(jù)實驗室的實際情況，我們將其稍作修改，做成了GLP文件，但其中仍有許多可改進或需要注意的地方，其中有一些對普通感受態(tài)效率的提高也有一定的幫助。 1、所用器具的潔凈程度。這一點非常重要，是所有與感受態(tài)有關的方法與文章上必講的，毋庸置疑。 2、培養(yǎng)基的裝量。培養(yǎng)基的裝量是很重要的，這關系到菌體生長過程中的能量代謝問題，是有氧還是無氧生長。厭氧生長出來的菌體是做不出效率高的感受態(tài)的。建議裝量不要高于此值：培養(yǎng)基體積/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。 3、培養(yǎng)基的pH值。這里講的pH值并非單指配制或滅菌后的pH值，而且還包括整個搖瓶結(jié)束后的pH值。一般來說，接種前的pH值在6.8-7.2。等菌搖好后，可以測一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝，生長狀態(tài)良好，按要求做，肯定效率不低。 4、培養(yǎng)后的OD值。其實這是一個非常重要的參數(shù)，只是當OD值大到一定的程度后，菌體要保持對數(shù)生長已經(jīng)不太可能，因此很多指導方法上強調(diào)OD不得大于 0.6、0.8等等。同時，OD值大時菌體總量大，感受態(tài)絕對數(shù)量要大一點。因此需要在OD值的兩方面影響中找一個平衡點。 5、培養(yǎng)基中的各種離子。經(jīng)驗證明，當培養(yǎng)基中存在一定量的Mg2+離子時，該方法制得的感受態(tài)要相對較高。在制備普通感受時，使用20mM MgCl2做為培養(yǎng)基的添加物，在感受態(tài)收獲之前20-30分鐘加入，會收到很好的效果。 6、培養(yǎng)溫度。文獻及經(jīng)驗告訴我們，較低的溫度培養(yǎng)有利于感受態(tài)的形成，這樣可以獲得較高的感受態(tài)，但太低又不實用，因而產(chǎn)生了Inoue的高效感受態(tài)制備方法，它實際是利用了所有有利于感受態(tài)的文獻而得出的一個非常理想方法。 7、此外文獻報道，在保存感受態(tài)時，DMSO要比甘油的效果要好，它會使感受態(tài)的效率增加。 8、液氮速凍也會使感受態(tài)的效率提高，因此推薦用液氮速凍感受態(tài)，然后保存于超低溫冰箱內(nèi)。至于在液氮中保存12小時以后再轉(zhuǎn)入超低溫冰箱，這點未做實驗，只是一種感覺，第一次這樣做了，沒問題，以后就照此辦理而已。 |
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