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濤濤不絕1988新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
魚(yú)類線粒體DNA的提取 已有1人參與
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我最近在做魚(yú)類線粒體DNA的提取，用的常規(guī)的堿裂解法提取的，提了7、8次了，但是跑完膠之后除了Maker什么也沒(méi)有，急啊~ 求高手幫忙分析一下，謝了！ （具體步驟：1、取動(dòng)物組織2-8g，用SE緩沖夜漂洗，剪碎，加入約30mlSE緩沖液，0℃勻漿,1500rpm 10min,取上清 12000rpm 15min，沉淀物為線粒體，用STM溶液洗一遍。 2、以溶液體積與組織重量0.2ml:1g的STM溶液懸浮線粒體，加DNaseA溶液，（終濃度達(dá)到100ug/ml）30℃水浴30min,加EDTA溶液（至終濃度10mmol/L）搖勻，10000rpm 10min，沉淀即線粒體。 3、取部分線粒體用Janus Green B染色并觀察線粒體的數(shù)目、大小。 4、剩余的線粒體用SE緩沖液洗一遍，然后用4mlSE溶液懸浮純凈線粒體，均分于4支EP管中。 5、12000rpm 10min；棄上清液，每管加150ulTEN溶液，懸浮沉淀，各加入300ul新配制的溶液Ⅴ，混合均勻，冰浴10min；再各加入225ul冷的KAc溶液，冰浴30min。 6、12000rpm 10min，取上清液; 加人與上清液等體積的飽和酚, 輕搖15min; 12000rpm 10min,取上清液; 加人與上清液等體積的氯仿-異戊醇(24 : 1 ) ,充分混合均勻，輕搖15min。12000rpm 10min, 吸取水相。 7、加入1/10體積的3mol/L、PH5.2的醋酸鈉，再加入兩倍體積無(wú)水乙醇，冰浴30min，12000rpm 10min,加入冷的（0℃）70%乙醇溶液洗一次，12000rpm 2min。自然干燥3-4 h或4℃ 冰箱中過(guò)夜徹底干燥；加入適量TE完全溶解。 8、加入DNase-free的RNaseA溶液（終濃度200ul/ml），37℃消化60min。重復(fù)步驟6和7。 9、取一部分溶液檢測(cè)mtDNA的純度和濃度，其余-20℃?zhèn)溆�。�? |
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xiayuling
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-08-18 15:16:41
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-08-18 15:16:41
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問(wèn)題可能在于DNAse。抽提過(guò)程中線粒體膜破裂，DNase把mtDNA給降解了。線粒體其實(shí)不是教科書(shū)所說(shuō)的一粒一粒的，而是空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，抽提時(shí)就有可能線粒體膜破裂了。 能否不用DNase？染色體的DNA很長(zhǎng)很大而且結(jié)合很多組蛋白，溫和裂解細(xì)胞后很容易被離心沉淀下來(lái)的，而線粒體DNA小的多。所以用常用的RNA抽提辦法，就可以抽提出RNA和mtDNA，然后用RNAase降解RNA，剩下的就是mtDNA。 |
4樓2012-08-18 05:55:15
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5樓2012-08-18 17:24:44
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6樓2013-08-31 10:17:38
7樓2014-05-11 22:01:53
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