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濤濤不絕1988新蟲 (初入文壇)
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[求助]
魚類線粒體DNA的提取 已有1人參與
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我最近在做魚類線粒體DNA的提取，用的常規(guī)的堿裂解法提取的，提了7、8次了，但是跑完膠之后除了Maker什么也沒有，急啊~ 求高手幫忙分析一下，謝了！ （具體步驟：1、取動物組織2-8g，用SE緩沖夜漂洗，剪碎，加入約30mlSE緩沖液，0℃勻漿,1500rpm 10min,取上清 12000rpm 15min，沉淀物為線粒體，用STM溶液洗一遍。 2、以溶液體積與組織重量0.2ml:1g的STM溶液懸浮線粒體，加DNaseA溶液，（終濃度達到100ug/ml）30℃水浴30min,加EDTA溶液（至終濃度10mmol/L）搖勻，10000rpm 10min，沉淀即線粒體。 3、取部分線粒體用Janus Green B染色并觀察線粒體的數(shù)目、大小。 4、剩余的線粒體用SE緩沖液洗一遍，然后用4mlSE溶液懸浮純凈線粒體，均分于4支EP管中。 5、12000rpm 10min；棄上清液，每管加150ulTEN溶液，懸浮沉淀，各加入300ul新配制的溶液Ⅴ，混合均勻，冰浴10min；再各加入225ul冷的KAc溶液，冰浴30min。 6、12000rpm 10min，取上清液; 加人與上清液等體積的飽和酚, 輕搖15min; 12000rpm 10min,取上清液; 加人與上清液等體積的氯仿-異戊醇(24 : 1 ) ,充分混合均勻，輕搖15min。12000rpm 10min, 吸取水相。 7、加入1/10體積的3mol/L、PH5.2的醋酸鈉，再加入兩倍體積無水乙醇，冰浴30min，12000rpm 10min,加入冷的（0℃）70%乙醇溶液洗一次，12000rpm 2min。自然干燥3-4 h或4℃ 冰箱中過夜徹底干燥；加入適量TE完全溶解。 8、加入DNase-free的RNaseA溶液（終濃度200ul/ml），37℃消化60min。重復步驟6和7。 9、取一部分溶液檢測mtDNA的純度和濃度，其余-20℃?zhèn)溆�。�? |
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濤濤不絕1988
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5樓2012-08-18 17:24:44
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