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thestormcong銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
pcr退火時(shí)間
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| 大家好，請(qǐng)教一個(gè)pcr的問(wèn)題。我的引物長(zhǎng)度約為70多個(gè)bp，那么在設(shè)計(jì)程序的時(shí)候，引物的退火時(shí)間大概要多長(zhǎng)呢，謝謝！ |
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thestormcong
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10樓2012-05-08 21:50:47
西瓜
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thestormcong: 回帖置頂 2012-05-09 21:08:50
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你是用PCR產(chǎn)物為模板，再用同樣的引物進(jìn)行擴(kuò)增嗎？這樣擴(kuò)增不好是很正常的。DNA聚合酶需要一些額外的堿基才能穩(wěn)定結(jié)合DNA模板，擴(kuò)增才好，一般十幾個(gè)bp就夠了。你可以設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，第一對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物在兩端都比實(shí)際需要的片段長(zhǎng)十幾個(gè)bp（幾十、上百bp都沒(méi)問(wèn)題，但是片段太長(zhǎng)會(huì)加大擴(kuò)增難度）。以此為模板進(jìn)行第二次PCR，用第二對(duì)引物把你真正要的片段再擴(kuò)增出來(lái)。說(shuō)白了就是巢式PCR：http://baike.baidu.com/view/688277.htm 第一輪PCR的產(chǎn)物要求很低，有目的條帶就好，雜帶、彌散這些都無(wú)所謂，第二輪PCR后就能得到特異條帶啦。 |
18樓2012-05-09 20:27:44
15樓2012-05-09 16:28:46
jmmchen
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| 引物越長(zhǎng)，退火時(shí)間應(yīng)稍微長(zhǎng)一些，1min左右應(yīng)該可以。 |
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thestormcong2樓2012-05-08 21:09:32
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-05-09 18:56:21
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-05-09 18:56:21
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Tm=4（G+C）+2(A+T),Tm值比退火溫度高5-15度。 退火溫度一般為55度-60度，GC<50％,一般用55度；GC>50％，一般用60度。若有非特異性帶，可提高退火溫度，但最好不要高于68度，合適的退火溫度在45-68度。 |
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3樓2012-05-08 21:12:58
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