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雨玫天晴新蟲 (小有名氣)
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[求助]
組織塊貼壁法培養(yǎng)細胞如何做？
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各位各位這里瞧下下哈，我是個菜鳥級別的，問一下菜鳥問題哦～那個組織塊貼壁培養(yǎng)細胞具體是個啥子過程嘞？細胞不純的話，怎么消化怎么傳代��？謝謝各位咯*^_^* [ 發(fā)自手機版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
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zhaohq1209: 金幣+3, BioEPI+1, telomerase: 金幣+4, 歡迎新蟲�。�！ 歡迎多多交流�。� 2012-05-09 09:13 2012-05-09 10:02:03
zhaohq1209: 金幣+3, BioEPI+1, telomerase: 金幣+4, 歡迎新蟲�。�！ 歡迎多多交流�。� 2012-05-09 09:13 2012-05-09 10:02:03
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很久以前做的，做法如下： 實驗所要用的工具都應(yīng)滅菌消毒。首先，在實驗前24h于60×15mm的培養(yǎng)皿內(nèi)鋪上血清，將鋪有血清的培養(yǎng)皿放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。。。。。。組織取出，用PBS將其沖洗干凈。將組織切割成1mm3左右的小塊。在剪切過程中，可以適當?shù)南蚪M織上滴1～2滴培養(yǎng)液，以保持濕潤。然后，將剪切好的組織塊用眼科鑷均勻鋪于事先準備好的培養(yǎng)皿內(nèi),加入少量含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，以組織塊不在培養(yǎng)液內(nèi)漂浮為宜，然后把培養(yǎng)皿放置在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)。放置2～4h后待組織小塊貼附于培養(yǎng)皿，加入含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃含5%的CO2的條件下培養(yǎng)，待1～2天后細胞由組織中游出，摘掉組織塊并用PBS清洗培養(yǎng)皿去除死細胞和組織殘留物，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待培養(yǎng)皿中的細胞長滿后用胰蛋白酶將其消化下來，轉(zhuǎn)入50ml的塑料培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，此時的細胞我們稱其為原代。。。。細胞。 至于純化，我做的是肺的，細胞相對含量不復雜，我要的細胞含量很高，所以穿幾代，就純化得差不多了。 要是肝的，那就不好做了。。。。。 |
2樓2012-05-09 09:13:08
雨玫天晴
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5樓2012-05-10 19:23:27
雨玫天晴
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6樓2012-05-10 19:38:02
chiscien 
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雨玫天晴: 回帖置頂 2012-05-12 06:59:16
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雨玫天晴: 回帖置頂 2012-05-12 06:59:16
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這里是我所知道的細胞培養(yǎng)純化的方法，希望能夠幫助到你的，上皮細胞的話，是會不純的，我們實驗室的上皮細胞一般能夠傳到5代的樣子。這里面有你需要的反復貼壁法的。你看看吧。 1、自然純化 即利用某一種類細胞的增殖優(yōu)勢，而排擠其他細胞生長，靠自然的增值潛力最后留下生長優(yōu)勢細胞，去除其他細胞。有些惡性腫瘤細胞可以通過此方法，自然純化建立細胞系。 2、人工純化 （1）酶消化法 在消化培養(yǎng)細胞時，常是成纖維細胞先脫壁，而上皮細胞要消化相當長的時間才脫壁，特別是在原代培養(yǎng)和培養(yǎng)早期這種差別尤為明顯，因而可以利用這種差異采用多次差別消化方法將上皮細胞和成纖維細胞分開。 （2）機械劃除法 原代培養(yǎng)成功后，上皮細胞和成纖維細胞所數(shù)都同時出現(xiàn)，混雜生長。這種混雜生長常常分區(qū)成片，每種細胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長在瓶壁上。因此可以采用機械的方法去除不需要的細胞。 （3）反復貼壁法 成纖維細胞與上皮細胞相比，其貼壁過程快，大部分細胞常能在短時間內(nèi)大約10－30min完成附著過程，而上皮細胞大部分在短時間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，這樣可以利用此差別來純化細胞。 （4）克隆法 采用細胞克隆法將細胞分成單個細胞，使之分別生長成克隆，選擇出所需要的克隆。 （5）培養(yǎng)及限定方法 某些細胞在生長過程中必須存在或必須去除某種物質(zhì)，否則無法生長，可以利用這種技術(shù)來純化細胞。 還有一種就是流式分選法，但是貌似很少用到的。 |
7樓2012-05-11 09:50:09
雨玫天晴
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8樓2012-05-12 06:57:35
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