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liuxing1-1至尊木蟲 (知名作家)
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[求助]
崩潰ing---PCR后無條帶問題
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本人打算做T-RFLP，現(xiàn)在正在做土壤總細(xì)菌16S PCR，引物是27F和1492R，PCR體系（25ul）是：dNTP（10UM） 0.5ul, 引物（10UM）各1uL，Taq E 0.5ul，10×buffer緩沖液（5U/uL），模板0.5uL，以水補(bǔ)齊。PCR條件是94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)，72℃下延伸10min。按照這個(gè)條件，無法P出條帶。期間，也換過EB染色液、TAE，但問題依舊。大家?guī)兔Ψ治鲆幌率鞘裁丛虬伞?br />
還有，用先前提取的大田土壤DNA可以P出來，但是用我前兩天剛剛提取的室內(nèi)土樣DNA竟然無法P出。下面?zhèn)�給出兩種DNA的具體參數(shù)： 土樣 濃度 260 280 260/280 260/230 PCR情況 大田 65.4 1.307 0.757 1.73 0.89 可以P出 室內(nèi) 59.6 1.192 0.680 1.75 0.25 無法P出 室內(nèi) 60.9 1.218 0.711 1.71 1.16 無法P出 請(qǐng)大家?guī)兔纯�，這是怎么回事啊 ？ |
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holyala
木蟲 (著名寫手)
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做16S一樣可以從DNA開始的，不一定要提RNA再RT-PCR。16S rDNA這也不是什么新鮮概念了。 問LZ一個(gè)問題，你提完DNA就只測(cè)一個(gè)紫外就完了么？沒有跑膠檢測(cè)一下？DNA降解是可能的原因之一。另外，建議你做PCR的時(shí)候設(shè)置兩個(gè)對(duì)照，陽性對(duì)照（確定能P出來的樣本做模板）和陰性對(duì)照（無模板，補(bǔ)水），這樣有利于分析結(jié)果，排除誤差。 |
4樓2012-05-10 15:07:33
cheng_xiao
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2樓2012-05-10 11:36:18
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5樓2012-05-10 16:29:14
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