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liuxing1-1

至尊木蟲(chóng) (知名作家)

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[求助] 崩潰ing---PCR后無(wú)條帶問(wèn)題

本人打算做T-RFLP，現(xiàn)在正在做土壤總細(xì)菌16S PCR，引物是27F和1492R，PCR體系（25ul）是：dNTP（10UM） 0.5ul, 引物（10UM）各1uL，Taq E 0.5ul，10×buffer緩沖液（5U/uL），模板0.5uL，以水補(bǔ)齊。PCR條件是94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)，72℃下延伸10min。按照這個(gè)條件，無(wú)法P出條帶。期間，也換過(guò)EB染色液、TAE，但問(wèn)題依舊。大家?guī)兔Ψ治鲆幌率鞘裁丛虬伞?br /> 還有，用先前提取的大田土壤DNA可以P出來(lái)，但是用我前兩天剛剛提取的室內(nèi)土樣DNA竟然無(wú)法P出。下面?zhèn)€給出兩種DNA的具體參數(shù)：
土樣濃度    260    280    260/280    260/230  PCR情況
大田 65.4    1.307    0.757    1.73          0.89       可以P出
室內(nèi) 59.6    1.192    0.680    1.75          0.25       無(wú)法P出
室內(nèi) 60.9    1.218 0.711 1.71          1.16       無(wú)法P出
請(qǐng)大家?guī)兔纯�，這是怎么回事啊？

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1樓 2012-05-10 08:34:02

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西瓜: 回帖置頂 2012-05-12 23:34:54

引用回帖:

12樓: Originally posted by elbo at 2012-05-12 11:29:50:
找到志同道合的了，我也在做TRFLP。首先一般情況下DNA都需要純化。反應(yīng)體系配置過(guò)程一定要仔細(xì)，建議加大模板量。 PCR條件自己摸索還是拿的別人，另外建議循環(huán)數(shù)減少到25,（據(jù)研究報(bào)道，減少循環(huán)數(shù)能夠減少堿基錯(cuò) ...

謝謝你的建議，這兩天開(kāi)始做出來(lái)了，很驚喜
加大模板量不一定行，我試過(guò)了

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13樓2012-05-12 12:57:37

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引用回帖:

2樓: Originally posted by cheng_xiao at 2012-05-10 11:36:18:
呵呵，個(gè)人淺見(jiàn)啊，我覺(jué)得是材料的問(wèn)題，你要的是16s核糖體RNA，這個(gè)家伙是翻譯蛋白用的，你室內(nèi)的的土樣肯定比大田活性低的多，你檢測(cè)時(shí)的結(jié)果大概是混有DNA，反正不能保證完全是RNA，你可以參考一下，實(shí)驗(yàn)順利啊

做16S一樣可以從DNA開(kāi)始的，不一定要提RNA再RT-PCR。16S rDNA這也不是什么新鮮概念了。

問(wèn)LZ一個(gè)問(wèn)題，你提完DNA就只測(cè)一個(gè)紫外就完了么？沒(méi)有跑膠檢測(cè)一下？DNA降解是可能的原因之一。另外，建議你做PCR的時(shí)候設(shè)置兩個(gè)對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照（確定能P出來(lái)的樣本做模板）和陰性對(duì)照（無(wú)模板，補(bǔ)水），這樣有利于分析結(jié)果，排除誤差。

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4樓2012-05-10 15:07:33

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14樓: Originally posted by elbo at 2012-05-12 19:34:56:
傳授一下你的經(jīng)驗(yàn)唄，怎么搞定的，

其實(shí)，我就是做了兩套體系，體系2 的DNA濃度加倍而已，這樣的情況下，大部分體系1 就能做出來(lái)，但是很少情況下，正好體系1 沒(méi)做出來(lái)，但是體系2 竟然出條帶了，所以，就這么配合著，都出來(lái)了

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16樓2012-05-13 10:23:30

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呵呵，個(gè)人淺見(jiàn)啊，我覺(jué)得是材料的問(wèn)題，你要的是16s核糖體RNA，這個(gè)家伙是翻譯蛋白用的，你室內(nèi)的的土樣肯定比大田活性低的多，你檢測(cè)時(shí)的結(jié)果大概是混有DNA，反正不能保證完全是RNA，你可以參考一下，實(shí)驗(yàn)順利啊

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我努力我?jiàn)^斗我成功

2樓2012-05-10 11:36:18

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我提取的是土壤DNA啊，不是RNA

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3樓2012-05-10 11:47:33

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4樓: Originally posted by holyala at 2012-05-10 15:07:33:
做16S一樣可以從DNA開(kāi)始的，不一定要提RNA再RT-PCR。16S rDNA這也不是什么新鮮概念了。

問(wèn)LZ一個(gè)問(wèn)題，你提完DNA就只測(cè)一個(gè)紫外就完了么？沒(méi)有跑膠檢測(cè)一下？DNA降解是可能的原因之一。另外，建議你做PCR的時(shí) ...

今天剛跑了膠，有條帶，但是不是非常清晰
是前兩天剛提取的dna，不能降解吧

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5樓2012-05-10 16:29:14

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5樓: Originally posted by liuxing1-1 at 2012-05-10 16:29:14:
今天剛跑了膠，有條帶，但是不是非常清晰
是前兩天剛提取的dna，不能降解吧

建議上圖。

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6樓2012-05-10 16:55:03

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左木堂堂主

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你提取土壤DNA是用的什么方法提的呢？我以前提的時(shí)候經(jīng)常出現(xiàn)P不出來(lái)的現(xiàn)象，很正常。很可能是土壤里面腐殖酸的干擾，你分別將土樣稀釋10倍 20倍 50倍看看，那樣能夠減少下干擾物質(zhì)的影響。此外，沒(méi)有做切膠回收直接P的嗎，還是用的專業(yè)的土壤DNA提取試劑盒？

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7樓2012-05-11 15:06:39

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7樓: Originally posted by 左木堂堂主 at 2012-05-11 15:06:39:
你提取土壤DNA是用的什么方法提的呢？我以前提的時(shí)候經(jīng)常出現(xiàn)P不出來(lái)的現(xiàn)象，很正常。很可能是土壤里面腐殖酸的干擾，你分別將土樣稀釋10倍 20倍 50倍看看，那樣能夠減少下干擾物質(zhì)的影響。此外，沒(méi)有做切膠回收直 ...

土壤試劑盒，omega的

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8樓2012-05-11 15:22:20

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我以前也出現(xiàn)過(guò)類似的問(wèn)題，后來(lái)干脆直接整成50微升的體系，這樣就好了。因?yàn)橛行㏄CR管子的質(zhì)量不是很好，會(huì)使酶液掛壁，影響PCR結(jié)果，總是P不出條帶，后來(lái)我最近用的管子比較好，15微升都能P出來(lái)。還有一種方法，就是在PCR體系中加入一點(diǎn)兒BSA(牛血清白蛋白)，好像對(duì)這種現(xiàn)象比較好用，不過(guò)我自己沒(méi)有試過(guò)，建議，你可以試試。

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9樓2012-05-11 19:51:27

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引用回帖:

8樓: Originally posted by liuxing1-1 at 2012-05-11 15:22:20:
土壤試劑盒，omega的

建議用Fast DNA SPIN Kit for Soil試劑盒，貌似你OMEGA的稍貴一點(diǎn)吧。提取出來(lái)的條帶明亮，后面的PCR很好做了。
你的情況，我用酚氯仿法提DNA的時(shí)候碰到過(guò)，我認(rèn)為還是提取出的DNA粗液雜質(zhì)污染太多了導(dǎo)致的。
你用的試劑盒提取，照理說(shuō)應(yīng)該是比較純的呀，會(huì)不會(huì)用力太粗暴導(dǎo)致條帶斷裂嚴(yán)重，影響擴(kuò)增效果。

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10樓2012-05-12 11:13:36

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[基金申請(qǐng)] 現(xiàn)在如何回避去年的某一個(gè)專家，不知道名字 +3	zk200107 2026-03-12	6/300	2026-03-14 17:13 by zk200107
[基金申請(qǐng)] 有必要更換申報(bào)口嗎 20+3	fannyamoy 2026-03-11	3/150	2026-03-14 00:52 by zhanghaozhu
[考研] 招收0805（材料）調(diào)劑 +3	18595523086 2026-03-13	3/150	2026-03-14 00:33 by 123%、
[考研] 求調(diào)劑（材料與化工327） +4	愛(ài)吃香菜啦 2026-03-11	4/200	2026-03-13 22:11 by JourneyLucky
[考研] 材料工程調(diào)劑 +9	咪咪空空 2026-03-12	9/450	2026-03-13 22:05 by 星空星月
[考研] 277求調(diào)劑 +4	anchor17 2026-03-12	4/200	2026-03-13 11:15 by 白夜悠長(zhǎng)