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liuxing1-1至尊木蟲(chóng) (知名作家)
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[求助]
崩潰ing---PCR后無(wú)條帶問(wèn)題
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本人打算做T-RFLP，現(xiàn)在正在做土壤總細(xì)菌16S PCR，引物是27F和1492R，PCR體系（25ul）是：dNTP（10UM） 0.5ul, 引物（10UM）各1uL，Taq E 0.5ul，10×buffer緩沖液（5U/uL），模板0.5uL，以水補(bǔ)齊。PCR條件是94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)，72℃下延伸10min。按照這個(gè)條件，無(wú)法P出條帶。期間，也換過(guò)EB染色液、TAE，但問(wèn)題依舊。大家?guī)兔Ψ治鲆幌率鞘裁丛虬伞?br />
還有，用先前提取的大田土壤DNA可以P出來(lái)，但是用我前兩天剛剛提取的室內(nèi)土樣DNA竟然無(wú)法P出。下面?zhèn)�給出兩種DNA的具體參數(shù)： 土樣 濃度 260 280 260/280 260/230 PCR情況 大田 65.4 1.307 0.757 1.73 0.89 可以P出 室內(nèi) 59.6 1.192 0.680 1.75 0.25 無(wú)法P出 室內(nèi) 60.9 1.218 0.711 1.71 1.16 無(wú)法P出 請(qǐng)大家?guī)兔纯矗@是怎么回事啊 ？ |
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做16S一樣可以從DNA開(kāi)始的，不一定要提RNA再RT-PCR。16S rDNA這也不是什么新鮮概念了。 問(wèn)LZ一個(gè)問(wèn)題，你提完DNA就只測(cè)一個(gè)紫外就完了么？沒(méi)有跑膠檢測(cè)一下？DNA降解是可能的原因之一。另外，建議你做PCR的時(shí)候設(shè)置兩個(gè)對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照（確定能P出來(lái)的樣本做模板）和陰性對(duì)照（無(wú)模板，補(bǔ)水），這樣有利于分析結(jié)果，排除誤差。 |
4樓2012-05-10 15:07:33
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| 你提取土壤DNA是用的什么方法提的呢？我以前提的時(shí)候經(jīng)常出現(xiàn)P不出來(lái)的現(xiàn)象，很正常。很可能是土壤里面腐殖酸的干擾，你分別將土樣稀釋10倍 20倍 50倍看看，那樣能夠減少下干擾物質(zhì)的影響。此外，沒(méi)有做切膠回收直接P的嗎，還是用的專業(yè)的土壤DNA提取試劑盒？ |
7樓2012-05-11 15:06:39
liuxing1-1
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| 我以前也出現(xiàn)過(guò)類似的問(wèn)題，后來(lái)干脆直接整成50微升的體系，這樣就好了。因?yàn)橛行㏄CR管子的質(zhì)量不是很好，會(huì)使酶液掛壁，影響PCR結(jié)果，總是P不出條帶，后來(lái)我最近用的管子比較好，15微升都能P出來(lái)。還有一種方法，就是在PCR體系中加入一點(diǎn)兒BSA(牛血清白蛋白)，好像對(duì)這種現(xiàn)象比較好用，不過(guò)我自己沒(méi)有試過(guò)，建議，你可以試試。 |
9樓2012-05-11 19:51:27
10樓2012-05-12 11:13:36
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