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liuxing1-1

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[求助] 崩潰ing---PCR后無(wú)條帶問(wèn)題

本人打算做T-RFLP，現(xiàn)在正在做土壤總細(xì)菌16S PCR，引物是27F和1492R，PCR體系（25ul）是：dNTP（10UM） 0.5ul, 引物（10UM）各1uL，Taq E 0.5ul，10×buffer緩沖液（5U/uL），模板0.5uL，以水補(bǔ)齊。PCR條件是94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)，72℃下延伸10min。按照這個(gè)條件，無(wú)法P出條帶。期間，也換過(guò)EB染色液、TAE，但問(wèn)題依舊。大家?guī)兔Ψ治鲆幌率鞘裁丛虬伞?br /> 還有，用先前提取的大田土壤DNA可以P出來(lái)，但是用我前兩天剛剛提取的室內(nèi)土樣DNA竟然無(wú)法P出。下面?zhèn)€給出兩種DNA的具體參數(shù)：
土樣濃度    260    280    260/280    260/230  PCR情況
大田 65.4    1.307    0.757    1.73          0.89       可以P出
室內(nèi) 59.6    1.192    0.680    1.75          0.25       無(wú)法P出
室內(nèi) 60.9    1.218 0.711 1.71          1.16       無(wú)法P出
請(qǐng)大家?guī)兔纯�，這是怎么回事啊？

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1樓 2012-05-10 08:34:02

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左木堂堂主

新蟲(chóng) (初入文壇)

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你提取土壤DNA是用的什么方法提的呢？我以前提的時(shí)候經(jīng)常出現(xiàn)P不出來(lái)的現(xiàn)象，很正常。很可能是土壤里面腐殖酸的干擾，你分別將土樣稀釋10倍 20倍 50倍看看，那樣能夠減少下干擾物質(zhì)的影響。此外，沒(méi)有做切膠回收直接P的嗎，還是用的專業(yè)的土壤DNA提取試劑盒？

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7樓2012-05-11 15:06:39

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cheng_xiao

木蟲(chóng) (小有名氣)

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呵呵，個(gè)人淺見(jiàn)啊，我覺(jué)得是材料的問(wèn)題，你要的是16s核糖體RNA，這個(gè)家伙是翻譯蛋白用的，你室內(nèi)的的土樣肯定比大田活性低的多，你檢測(cè)時(shí)的結(jié)果大概是混有DNA，反正不能保證完全是RNA，你可以參考一下，實(shí)驗(yàn)順利啊

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我努力我?jiàn)^斗我成功

2樓2012-05-10 11:36:18

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liuxing1-1

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引用回帖:

2樓: Originally posted by cheng_xiao at 2012-05-10 11:36:18:
呵呵，個(gè)人淺見(jiàn)啊，我覺(jué)得是材料的問(wèn)題，你要的是16s核糖體RNA，這個(gè)家伙是翻譯蛋白用的，你室內(nèi)的的土樣肯定比大田活性低的多，你檢測(cè)時(shí)的結(jié)果大概是混有DNA，反正不能保證完全是RNA，你可以參考一下，實(shí)驗(yàn)順利啊

我提取的是土壤DNA啊，不是RNA

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3樓2012-05-10 11:47:33

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holyala

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做16S一樣可以從DNA開(kāi)始的，不一定要提RNA再RT-PCR。16S rDNA這也不是什么新鮮概念了。

問(wèn)LZ一個(gè)問(wèn)題，你提完DNA就只測(cè)一個(gè)紫外就完了么？沒(méi)有跑膠檢測(cè)一下？DNA降解是可能的原因之一。另外，建議你做PCR的時(shí)候設(shè)置兩個(gè)對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照（確定能P出來(lái)的樣本做模板）和陰性對(duì)照（無(wú)模板，補(bǔ)水），這樣有利于分析結(jié)果，排除誤差。

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4樓2012-05-10 15:07:33

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