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weining1203新蟲 (小有名氣)
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[求助]
膠回收后再次pcr無目的條帶，急，望神人指點。。。 已有1人參與
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由于有雜帶，將目的帶膠回收后，進行二次pcr，將模板稀釋100倍和1000倍，還是p不出，退貨溫度為梯度，求大神指點。。。第二張圖片中彌散條帶比較長的為沒有稀釋模板的，左邊的為模板稀釋1000倍的，稀釋100倍的和1000倍的pcr圖基本一樣，不再上傳了。。。兩次pcr條件一致。。。圖和說明在下面 第一次pcr圖，目的帶860bp左右，但有雜帶 二次pcr圖，左邊的為模板稀釋1000倍的，右邊的模板沒有稀釋 |
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| 二次PCR突變較多，做基因克隆的話，不建議二次PCR。稀釋100倍，1000倍的話離子濃度應(yīng)該已經(jīng)不會有影響了，可能是濃度太低了。建議回收后用ddH2O溶解，取1ul做模板就OK了。 |
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weining12037樓2012-05-14 15:26:45
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| 如果你直接把第一塊膠的目的片段回收的話，那應(yīng)該是量太少了。用40-50微升PCR產(chǎn)物跑膠，再回收。然后可以把多條切下的膠混合，增加產(chǎn)物濃度。因為過柱的膠純化本身會造成很多損失，所以要把其實的濃度加大。 |
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2樓2012-05-13 22:49:11
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵交流經(jīng)驗 2012-06-15 13:49:11
| 你切膠回收是切幾個帶呀？我們一般是25ulPCR產(chǎn)物全電泳，兩個帶合一用試劑盒回收溶20~25ul，然后直接電泳都能看到條帶的。所以，你的首要問題就是回收有問題，可能回收產(chǎn)物濃度太低。其次，你回收產(chǎn)物的濃度肯定不如原模板的濃度，最好不要再稀釋，倒是可以做個不同模板量的梯度PCR |
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8樓2012-05-14 20:46:11
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9樓2012-05-15 10:11:54
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10樓2012-05-15 10:14:06
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