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weining1203新蟲 (小有名氣)
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[求助]
膠回收后再次pcr無(wú)目的條帶，急，望神人指點(diǎn)。。。 已有1人參與
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由于有雜帶，將目的帶膠回收后，進(jìn)行二次pcr，將模板稀釋100倍和1000倍，還是p不出，退貨溫度為梯度，求大神指點(diǎn)。。。第二張圖片中彌散條帶比較長(zhǎng)的為沒(méi)有稀釋模板的，左邊的為模板稀釋1000倍的，稀釋100倍的和1000倍的pcr圖基本一樣，不再上傳了。。。兩次pcr條件一致。。。圖和說(shuō)明在下面 第一次pcr圖，目的帶860bp左右，但有雜帶 二次pcr圖，左邊的為模板稀釋1000倍的，右邊的模板沒(méi)有稀釋 |
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weining1203
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3樓2012-05-14 09:28:20
legend0463
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-05-14 13:40:08
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-05-14 13:40:08
| 如果你直接把第一塊膠的目的片段回收的話，那應(yīng)該是量太少了。用40-50微升PCR產(chǎn)物跑膠，再回收。然后可以把多條切下的膠混合，增加產(chǎn)物濃度。因?yàn)檫^(guò)柱的膠純化本身會(huì)造成很多損失，所以要把其實(shí)的濃度加大。 |
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2樓2012-05-13 22:49:11
小白蝦
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4樓2012-05-14 09:34:30
xiazhiwuxie
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-05-14 13:40:21
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-05-14 13:40:21
| 首先，第一次PCR產(chǎn)物，你是回收了哪一條？膠回收了能看到目的條帶，第二次做不出來(lái)，很有可能這不是你要的條帶。要不你就把第一次回收的坐一下連接，轉(zhuǎn)到大腸桿菌去測(cè)序吧，我們以前PCR條帶很弱的情況都連接測(cè)序過(guò)，沒(méi)有問(wèn)題的，但個(gè)人覺(jué)得，連純化的產(chǎn)物也跑不出條帶，菌液PCR估計(jì)很難吧。PCR產(chǎn)物可以去測(cè)序的，但是一般前面一部分不太準(zhǔn)，而且濃度和量都有要求的。 |
5樓2012-05-14 09:37:39
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