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[交流]
蛋白激酶原核表達 已有5人參與
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大家好： 我先要原核表達純化一中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶， 我們實驗室做的是細菌，一般用PET-28a或32a表達載體，轉(zhuǎn)入BL21中，上Ni柱親和純化重組蛋白。開始原核表達前會分析該蛋白的信號肽、跨膜區(qū)，一般去除跨膜區(qū)再原核表達的。我的問題是： 1、我要表達的這個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶由660個氨基酸組成，跨膜區(qū)在中間，即蛋白一部分在膜內(nèi)，一半在膜外。若去除跨膜區(qū)，蛋白活性會不會有影響？因為該蛋白是一種激酶。 2、若全長表達，編碼基因過長我�，F(xiàn)在是全長克隆，剛連上PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化后挑陽性克隆測序，測序序列與我們目的基因序列不能100%吻合，已測過6次序列，均不能100%成功。怎么辦呢？ 3、表達載體要不要換呢？ 歡迎各位提出寶貴意見，謝謝。 |
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木蟲 (正式寫手)
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silicare: 金幣+6, BioEPI+1, 應(yīng)助指數(shù)+1, 第二個需要高保真酶pfu，taq是不行的 2012-05-22 12:58:32
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
silicare: 金幣+6, BioEPI+1, 應(yīng)助指數(shù)+1, 第二個需要高保真酶pfu，taq是不行的 2012-05-22 12:58:32
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因為我最近在做腸激酶，所以給你說說我的想法。 第一個問題：你首先要確定你的蛋白，去NCBI或者uniport，找出相對應(yīng)的序列，上面有活性位點的區(qū)域標識，你把你的跨膜區(qū)表達蛋白序列區(qū)間去比對，看是不是在活性區(qū)間內(nèi)。才能確定是否影響。 第二個問題，說明你的insert有問題，要不就是在準備提質(zhì)粒過程中生長突變了，不過可能性不大。還有最大可能就是你PCR目的基因片段時候的Taq酶有問題，建議你試試takara master mix試試，我們最近也換這種的，效果很好，P的也快。 第三個問題，如果你的載體能連接上目的基因就是沒問題的，那就不要換了，省的還要重新設(shè)計引物，還要P載體。 好像就這么多了。希望能幫上你。 |
7樓2012-05-22 09:08:13
2樓2012-05-20 08:43:17
3樓2012-05-20 13:24:31
shenlin0514
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4樓2012-05-21 09:17:30
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