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[交流]
質(zhì)粒構(gòu)建疑難雜癥
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本人近期構(gòu)建質(zhì)粒碰到一些問題在這里想很大家一起討論： 1：載體和目的片段酶切，回收后連接轉(zhuǎn)化提質(zhì)粒后回發(fā)現(xiàn)有很多空載，我想其可能原因之一是載體發(fā)生了單酶切，其二載體沒有切開。可是我是過夜酶切應(yīng)該能是切開的，若果載體沒有切開那么在切膠回收時(shí)也是可以分開的，有點(diǎn)疑惑。 對(duì)于轉(zhuǎn)化后的空載問題各位是怎樣避免的。 2：近期轉(zhuǎn)化后提質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)很多質(zhì)粒比空載小1000-2000bp,有的也比空載小點(diǎn)，出現(xiàn)這種情況有點(diǎn)疑惑了。我酶是用ECOR1和XHO1。 3：我pcr目的基因由TAQ酶可以很好擴(kuò)增出來，可PFU始終不可以，不知大家有沒有什么提高TAQ酶保真性的方法。 4;大家認(rèn)為在克隆基因方面的一些關(guān)鍵點(diǎn)。 |
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我是用的T載體，只用了Amp抗生素篩選，實(shí)驗(yàn)室說藍(lán)白篩選假陽性太多。我沒有確定我的質(zhì)粒少了1000-2000bp，是我挑去單克隆提質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn)，大部分都比我的空載要小，有的甚至要小1000-2000bp，有的只小一點(diǎn)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室PFU不是很好，是北京索萊寶的，用TAQ可以而pfu不行，可能與酶有關(guān)。 用T載體連接后酶切發(fā)現(xiàn)由我的目的片段，可送去測序后測序結(jié)果顯示是雙峰，網(wǎng)上查詢說T載體中連接片段有正向和反向，不知你有沒有遇到過此種情況。謝謝 |
17樓2012-05-19 10:35:56
22樓2012-05-20 16:29:03
15樓2012-05-19 07:47:24
★
wcx蝸牛(金幣+1): 謝謝參與
wcx蝸牛(金幣+1): 謝謝參與
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本帖內(nèi)容被屏蔽 |
2樓2012-05-18 20:24:45
7樓2012-05-18 21:11:02
★ ★ ★ ★ ★ ★
wcx蝸牛(金幣+1): 謝謝參與
wcx蝸牛: 金幣+3 2012-05-19 10:15:44
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-05-20 09:09:18
wcx蝸牛(金幣+1): 謝謝參與
wcx蝸牛: 金幣+3 2012-05-19 10:15:44
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-05-20 09:09:18
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[1]不知道你的載體是只能通過抗生素篩選，還是具有藍(lán)白斑篩選的區(qū)域，如果是后者，可以考慮用抗生素和藍(lán)白斑篩選兩個(gè)同時(shí)進(jìn)行，例如T-載體就是需要這樣的標(biāo)準(zhǔn)操作。 [2]未酶切的質(zhì)粒電泳上可能出現(xiàn)三條帶：超螺旋，標(biāo)準(zhǔn)，線性 不知道你是如何確定你的質(zhì)粒是少了1000-2000bp [3]酶的廠家很重要，你用的那家公司的PFU？我個(gè)人覺的高保真酶FERMANTAS的HS PREMIE 很不錯(cuò)，當(dāng)然實(shí)驗(yàn)室有銀子，全上NEB的酶，那就更好了。。。 |
8樓2012-05-18 22:14:56
12樓2012-05-19 00:03:57
16樓2012-05-19 10:13:17
18樓2012-05-19 14:03:47
★ ★ ★
西瓜: 金幣+3, Good！ 2012-05-20 18:42:55
西瓜: 金幣+3, Good！ 2012-05-20 18:42:55
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"我是用的T載體，只用了Amp抗生素篩選，實(shí)驗(yàn)室說藍(lán)白篩選假陽性太多。我沒有確定我的質(zhì)粒少了1000-2000bp，是我挑去單克隆提質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn)，大部分都比我的空載要小，有的甚至要小1000-2000bp，有的只小一點(diǎn)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室PFU不是很好，是北京索萊寶的，用TAQ可以而pfu不行，可能與酶有關(guān)。 用T載體連接后酶切發(fā)現(xiàn)由我的目的片段，可送去測序后測序結(jié)果顯示是雙峰，網(wǎng)上查詢說T載體中連接片段有正向和反向，不知你有沒有遇到過此種情況。謝謝" [1]其實(shí)T-載體連接用不用藍(lán)白斑沒有太大影響的（我們隔壁的實(shí)驗(yàn)室一直用藍(lán)白斑 ，他們跟我說假陽性不是很多，只要運(yùn)氣不是背到家，挑個(gè)5個(gè)之內(nèi)，都會(huì)有正�？寺〉模�?yàn)檎Ｇ闆r下假陽性會(huì)非常少，除非你的片段特別長，例如超過T-載體的載樣量什么的。 [2]T載體的確是有正向和反向。這個(gè)分兩種情況 1）如果你的片段700bp左右，一個(gè)單向測序就可以解決，你得到結(jié)果后，跟你的目的片段進(jìn)行對(duì)比，因?yàn)檎聪虻膯栴}，你需要將對(duì)比序列正向?qū)Ρ认拢俜聪蚧パa(bǔ)下，再對(duì)比下，來確定。 2）如果你的片段大于1000bp，這意味著你要雙向測序，還要拼接，建議你找個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，比較說啟動(dòng)子，或者酶切位點(diǎn)的位置作為標(biāo)記，正，反向?qū)Ρ葧r(shí) 好尋找。 |
19樓2012-05-19 14:09:42
★
wcx蝸牛(金幣+1): 謝謝參與
wcx蝸牛(金幣+1): 謝謝參與
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確保雙酶切時(shí)的兩個(gè)酶都完全酶切很重要。 而且請(qǐng)注意，不同的酶切相同的質(zhì)粒所需的酶量是不同的。因而別人的酶切經(jīng)驗(yàn)對(duì)你的酶切實(shí)驗(yàn)可能沒有太多的幫助。 關(guān)于雙酶切設(shè)計(jì)，我覺得你可以嘗試用double digestion designer計(jì)算你的雙酶切所需的精確酶量，不用猜測酶是否夠多，而且切1個(gè)小時(shí)完全足夠了，一般不需要延長時(shí)間。具體網(wǎng)址是http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php 祝一切順利。 |
20樓2012-05-20 08:35:52
21樓2012-05-20 10:16:19
23樓2012-05-21 15:02:01
簡單回復(fù)
2012-05-18 20:36
回復(fù)
wcx蝸牛(金幣+1): 謝謝參與
2012-05-18 20:36
回復(fù)
2012-05-18 20:50
回復(fù)
wcx蝸牛(金幣+1): 謝謝參與
2012-05-18 20:53
回復(fù)
wcx蝸牛(金幣+1): 謝謝參與
cilinxue9樓
2012-05-18 22:26
回復(fù)
wcx蝸牛(金幣+1): 謝謝參與
支持下
yanhj010樓
2012-05-18 22:45
回復(fù)
wcx蝸牛(金幣+1): 謝謝參與
奮力拼搏11樓
2012-05-18 23:44
回復(fù)
wcx蝸牛(金幣+1): 謝謝參與
foreve13樓
2012-05-19 00:10
回復(fù)
wcx蝸牛(金幣+1): 謝謝參與
覃理梅sbejcf14樓
2012-05-19 00:17
回復(fù)
wcx蝸牛(金幣+1): 謝謝參與
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