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NADPH氧化酶的測得
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已經(jīng)測過一次NADPH氧化酶的活性，但是數(shù)值沒有變化，不知道是哪里出現(xiàn)了問題。實驗的時候沒有找到具體的操作步驟，只是找了N 篇文獻綜合總結(jié)了一下，想的實踐出真知，就大膽的做了，結(jié)果失敗了。哪位仁兄測過，指點一二。 我參照的實驗方法： 由NADPH氧化酶生成的活性氧產(chǎn)物被檢測到，在25度下，SOD抑制的，NADPH依賴的在550nm下細胞色素C的減少。像Heyworth et al （1993）描述那樣，反應(yīng)混合液包括0.1mM的細胞色素C，6.5mMMgCL,87Mmkcl,2.6mMNaCL,8.7mMPipes,Ph 7.3,10pM GTP(y)S,0.16Mmnadph,he10-15pg質(zhì)膜蛋白，總體積1ml。對照試驗包括50pg的SOD來說明在沒有活性氧依賴的細胞色素的減少。DPI（at 5 pM），質(zhì)膜NADPH氧化酶的一種酶激活不可逆抑制劑，抑制激發(fā)子激發(fā)的NADPH氧化酶的活性。 我遇到的問題： 膜蛋白是高速離心后提取的，應(yīng)該沒有什么問題。測定時加的是150微克。 我遇到的問題是：1，加入SOD和不加sod的對照和處理，及重復(fù)之間的吸光值都在0.200-0.215之間，數(shù)值之間沒有差異。 2，雖然現(xiàn)在實驗還沒有做出來，但是希望您能把計算的公式也給我一份。 因為我沒有找到詳細的實驗步驟。實驗準備的時候我綜合了好幾個實驗版本。下面是我的操作步驟，以便你幫助我找到我錯誤的地方：1 先加膜蛋白 2 （將所用的試劑配成混合液，有兩份，一份加了SOD,一份沒有）加入反應(yīng)混合液。 3 加入NADPH啟動反應(yīng)，5min后測定其吸光值。 我一個處理做了6管，3管加的是有SOD的混合液，另外3管加的是沒有SOD的混合液。 其實我也試過加入NADPH后立即測其5min的吸光值，但是在5min的反應(yīng)過程中，吸光值根本沒有變化。加入濃度的NADPH時吸光值有微小的變化。 |
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送鮮花一朵
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2樓2012-05-25 23:58:39
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3樓2013-01-28 13:02:12
starseacow
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
額敏的雪: 金幣+5 2013-01-29 10:53:05
額敏的雪: 金幣+5 2013-01-29 10:53:05
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我以前測植物NADPH氧化酶活性方法如下 Plasma membrane vesicles were isolated from Arabidopsis leaves using two-phase partitioning according to a procedure described previously (Qiu et al., 2002). The membrane vesicles were resuspended in a 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, and used immediately for NADPH oxidase activity assays. A total of 1 μM 16:0-18:2 PA, 16:0-18:2 PC, or lysoPA or 10 μM (±) ABA (final ethanol, 0.02% [v/v]) was applied to the membrane vesicles (3 to 6 μg), respectively, and incubated in the reaction buffer (50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, and 0.5 mm XTT). NADPH (50 μM) was used to initiate the reaction. After 10 min at 25°C, the reaction solution was used for spectrophotometric analysis of XTT formazan production at A470. NADPH activity was expressed as ΔA470 per milligram protein per minute. ΔA470 represents the difference in XTT formazan absorbance at 470 nm in the presence and absence of 100 units of SOD. Zhang et al. The Plant Cell August 2009 vol. 21 no. 8 2357-2377 Heyworth的方法貌似是測動物細胞的，樓主引用的方法像是谷歌翻譯出來的，有仔細看那篇原始文獻么？我不確定這個方法是否也適用于植物細胞。 |
4樓2013-01-28 19:07:46
餓的神啊
新蟲 (著名寫手)
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- 性別: MM
- 專業(yè): 植物病理學(xué)
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你好，我也要測植物葉片中NADPH氧化酶活性，沒明白這句話是什么意思，你能不能仔細講一講啊！ A total of 1 μM 16:0-18:2 PA, 16:0-18:2 PC, or lysoPA or 10 μM (±) ABA (final ethanol, 0.02% ) was applied to the membrane vesicles (3 to 6 μg), respectively, and incubated in the reaction buffer (50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, and 0.5 mm XTT). |
5樓2015-07-11 17:02:40
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