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[求助]
NADPH氧化酶的測(cè)得
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已經(jīng)測(cè)過(guò)一次NADPH氧化酶的活性，但是數(shù)值沒(méi)有變化，不知道是哪里出現(xiàn)了問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)的時(shí)候沒(méi)有找到具體的操作步驟，只是找了N 篇文獻(xiàn)綜合總結(jié)了一下，想的實(shí)踐出真知，就大膽的做了，結(jié)果失敗了。哪位仁兄測(cè)過(guò)，指點(diǎn)一二。 我參照的實(shí)驗(yàn)方法： 由NADPH氧化酶生成的活性氧產(chǎn)物被檢測(cè)到，在25度下，SOD抑制的，NADPH依賴的在550nm下細(xì)胞色素C的減少。像Heyworth et al （1993）描述那樣，反應(yīng)混合液包括0.1mM的細(xì)胞色素C，6.5mMMgCL,87Mmkcl,2.6mMNaCL,8.7mMPipes,Ph 7.3,10pM GTP(y)S,0.16Mmnadph,he10-15pg質(zhì)膜蛋白，總體積1ml。對(duì)照試驗(yàn)包括50pg的SOD來(lái)說(shuō)明在沒(méi)有活性氧依賴的細(xì)胞色素的減少。DPI（at 5 pM），質(zhì)膜NADPH氧化酶的一種酶激活不可逆抑制劑，抑制激發(fā)子激發(fā)的NADPH氧化酶的活性。 我遇到的問(wèn)題： 膜蛋白是高速離心后提取的，應(yīng)該沒(méi)有什么問(wèn)題。測(cè)定時(shí)加的是150微克。 我遇到的問(wèn)題是：1，加入SOD和不加sod的對(duì)照和處理，及重復(fù)之間的吸光值都在0.200-0.215之間，數(shù)值之間沒(méi)有差異。 2，雖然現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)還沒(méi)有做出來(lái)，但是希望您能把計(jì)算的公式也給我一份。 因?yàn)槲覜](méi)有找到詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備的時(shí)候我綜合了好幾個(gè)實(shí)驗(yàn)版本。下面是我的操作步驟，以便你幫助我找到我錯(cuò)誤的地方：1 先加膜蛋白 2 （將所用的試劑配成混合液，有兩份，一份加了SOD,一份沒(méi)有）加入反應(yīng)混合液。 3 加入NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，5min后測(cè)定其吸光值。 我一個(gè)處理做了6管，3管加的是有SOD的混合液，另外3管加的是沒(méi)有SOD的混合液。 其實(shí)我也試過(guò)加入NADPH后立即測(cè)其5min的吸光值，但是在5min的反應(yīng)過(guò)程中，吸光值根本沒(méi)有變化。加入濃度的NADPH時(shí)吸光值有微小的變化。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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額敏的雪: 金幣+5 2013-01-29 10:53:05
額敏的雪: 金幣+5 2013-01-29 10:53:05
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我以前測(cè)植物NADPH氧化酶活性方法如下 Plasma membrane vesicles were isolated from Arabidopsis leaves using two-phase partitioning according to a procedure described previously (Qiu et al., 2002). The membrane vesicles were resuspended in a 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, and used immediately for NADPH oxidase activity assays. A total of 1 μM 16:0-18:2 PA, 16:0-18:2 PC, or lysoPA or 10 μM (±) ABA (final ethanol, 0.02% [v/v]) was applied to the membrane vesicles (3 to 6 μg), respectively, and incubated in the reaction buffer (50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, and 0.5 mm XTT). NADPH (50 μM) was used to initiate the reaction. After 10 min at 25°C, the reaction solution was used for spectrophotometric analysis of XTT formazan production at A470. NADPH activity was expressed as ΔA470 per milligram protein per minute. ΔA470 represents the difference in XTT formazan absorbance at 470 nm in the presence and absence of 100 units of SOD. Zhang et al. The Plant Cell August 2009 vol. 21 no. 8 2357-2377 Heyworth的方法貌似是測(cè)動(dòng)物細(xì)胞的，樓主引用的方法像是谷歌翻譯出來(lái)的，有仔細(xì)看那篇原始文獻(xiàn)么？我不確定這個(gè)方法是否也適用于植物細(xì)胞。 |
4樓2013-01-28 19:07:46
餓的神啊
新蟲(chóng) (著名寫手)
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- 專業(yè): 植物病理學(xué)
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你好，我也要測(cè)植物葉片中NADPH氧化酶活性，沒(méi)明白這句話是什么意思，你能不能仔細(xì)講一講��！ A total of 1 μM 16:0-18:2 PA, 16:0-18:2 PC, or lysoPA or 10 μM (±) ABA (final ethanol, 0.02% ) was applied to the membrane vesicles (3 to 6 μg), respectively, and incubated in the reaction buffer (50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, and 0.5 mm XTT). |
5樓2015-07-11 17:02:40
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