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[求助]
克隆目的基因
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一直在從一個全基因組不知道的菌種克隆目的基因，最近根據(jù)同源性設(shè)計了兼并引物�，F(xiàn)在遇到了以下這些問題： 1.用兼并引物P目的片段時，使用梯度PCR做的，確定退火溫度在58—65之間都有條帶，最后回收膠，做連接，轉(zhuǎn)化，藍(lán)白斑篩選，挑了18個白斑進(jìn)行菌落PCR，發(fā)現(xiàn)沒有目標(biāo)條帶。（注：因?yàn)槭切率�，切膠回收時切得有些寬，師姐說可能回收率太低） 2.介于上次失敗，所以就從頭開始做一次克隆，所選的退火溫度是62℃。但是這次居然沒有P出來。  只有一條很淡的條帶，這也沒法回收啊。所以請高手指點(diǎn)一下啦。萬分感謝。 |
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8樓2012-05-28 21:40:08
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2樓2012-05-28 00:45:26
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3樓2012-05-28 00:47:30
maoyong
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4樓2012-05-28 08:16:19
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trizol11
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你這種情況很正常，需要多嘗試一下 第一，你不一定就局限于62°，可以換一個， 第二，切膠時盡量少切沒用的空白膠，我有個師兄號稱是“劉三刀”，因?yàn)樵匐y看的膠他三刀之內(nèi)都切的不錯，可以學(xué)習(xí)這個，反正盡量把膠切薄，切少 第三，聚落pcr效率有點(diǎn)差，你可以用1ml的管子小搖一下，37°估計2~3h就差不多了吧，具體忘記了，之后菌液p或者抽質(zhì)粒再做 |
7樓2012-05-28 14:34:54
trizol11
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9樓2012-05-29 12:10:53
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