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草帽小子銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
求原核表達(dá)誘導(dǎo)表達(dá)具體操作？？？
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| 我選擇的PET32a，把我差不多600bp的目的片段連入了pet32a。轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株Rosset。下一步就是要做誘導(dǎo)表達(dá)了！可是我從來(lái)都沒(méi)做過(guò)，還是有好多的細(xì)節(jié)不清楚��！惶恐，求高人指點(diǎn)！我看別人的文章里用到1XPBS，2XSDS，不知道1XPBS和2XSDS的配方是怎樣的？？Sample Text因?yàn)槭遣畈欢?00bp，所以我的目的蛋白應(yīng)該是21KD左右。不知道選擇PET32a載體，前面是否會(huì)多編碼一段蛋白��？我的目的序列是從ATG開(kāi)始的！我應(yīng)該選擇分離膠和濃縮膠的濃度各是多大喃？在SDS-PAGE過(guò)程中，緩沖液用的是什么�。渴裁礃拥呐浞桨�？我應(yīng)該怎樣安排對(duì)照比較好喃？有什么特別要注意的么？求高人指點(diǎn)！ |
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草帽小子2樓2012-06-04 12:33:38
3樓2012-06-04 12:52:20
roomofxw
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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草帽小子: 金幣+10, ★有幫助, 很感謝！ 2012-06-04 16:31:57
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pET32，如果你用NdeI插入的話，那就不會(huì)多編碼，用其他的會(huì)多出一段TrxA標(biāo)簽，大約11kDa吧，具體請(qǐng)看pET32的圖譜。 1×PBS就是磷酸緩沖液，2×SDS就是濃度兩倍的SDS母液。 至于誘導(dǎo)表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟，見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 SDS-PAGE電泳技術(shù)，具體見(jiàn)蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè) |
4樓2012-06-04 13:20:06
5樓2012-06-04 14:48:26
草帽小子
銀蟲(chóng) (小有名氣)
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6樓2012-06-04 16:30:50
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-06-07 13:44:44
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http://biotech.ou.edu/ 是預(yù)測(cè)可溶概率的，當(dāng)然只是概率 首先看文獻(xiàn)啊，別人做過(guò)或者類似蛋白是不是包涵體 然后就是跑電泳的時(shí)候啊，你跑的全菌，破菌上清，和破菌沉淀里面，目的條帶在沉淀里面的，只要不是破菌沒(méi)破開(kāi)，那就是包涵體了 |
7樓2012-06-04 16:37:00
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8樓2012-06-04 16:47:53
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9樓2012-06-04 16:48:28
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10樓2012-06-04 16:49:46
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