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xiaohuibit銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
方法驗證實驗這么做對嗎？
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LOD和LOQ的做法： QL = 10 σ /S DL=3.3σ /S where σ = the standard deviation of the response S = the slope of the calibration curve The slope S may be estimated from th ... 謝謝您的回復(fù)。我本來是分析的門外漢，但是現(xiàn)在人在國外，只能做這方面的研究。快被所謂的方法驗證理論逼瘋了，已經(jīng)接近兩個月了，我查了很多資料，但是發(fā)現(xiàn)幾乎所有的人對驗證過程的細節(jié)均一帶而過，就給出一個什么加標實驗，回收率的表格，有的甚至就一句話。所以我估計我的問題不在于看資料少，而在于細節(jié)東西心里沒把握。 比如我用熒光淬滅劑先去抑制一種染料的熒光，然后在這個體系中加入待檢物后發(fā)現(xiàn)熒光重新增強。那么我要驗證我提出的這個分析方法，照我的理解是不是應(yīng)該按以下步驟進行： １首先根據(jù)先期實驗結(jié)果，選取幾個濃度點(如７個點，每個重復(fù)測３次，取平均值)，測試熒光強度，然后做用熒光值或者熒光面積值(順便問一下用面積計算，應(yīng)當取什么區(qū)間，有沒有標準規(guī)定，還是自己看著辦)為縱軸，以濃度為橫軸，做出線性關(guān)系來。在我理解這個線性關(guān)系就是所謂的標準曲線。而曲線不一定非要過零點吧。如果有截距和斜率，貌似斜率就是上述公式中的S,那么截距是不是沒什么用？還是也有其他用處？ ２得到線性相關(guān)系數(shù)大于３個９的工作曲線之后，是不是就可以做檢出限了？具體方法我覺得好像是取一個低濃度的試樣，重復(fù)檢測１１次，然后得到１１個不同的熒光強度，是把這１１個熒光值直接求標準方差，然后除以斜率再乘以系數(shù)就可以得到檢測限了嗎？(就是用你給出的兩個公式)還是應(yīng)該將這１１個熒光強度值代入工作曲線，得出１１個濃度值，求濃度的標準方差呢？(或許兩者是一個值，本人數(shù)學(xué)比較差，所以不清楚)。因為我始終搞不明白σ /S的比值為什么會是濃度的量綱呢？費解呀。。。。到底中間過程是怎樣呢？跪求高手指教！ ３在得到檢出限的基礎(chǔ)上，我是不是可以做加標回收率試驗了。具體方法是在一個已知待測物含量的樣品中加入已知濃度一定量的待測樣，然后就得到一個新的熒光值，代入工作曲線，得到加樣之后的濃度，回收率的求法是用加樣測得的濃度算出質(zhì)量減去未加樣前待測物質(zhì)量的差再除以加入的待測物質(zhì)量，對嗎？那么所謂的RSD又是怎么回事呢？是每個加樣濃度重復(fù)測５次，計算出的recovery的相對標準偏差嗎？還是濃度的偏差？不清楚呀。。。。 ４用濃度的標準方差或者相對標準方差是不是就能說明精密度和準確度了，還是又需要做什么其他實驗？ ５ 如果想發(fā)表文章，是不是必須用生物體的樣本(比如尿樣或者血清樣本)進行稀釋后檢測，才能最終確認方法的正確性。也就是檢驗一下方法的抗干擾能力。對不對呢？ 以上是本人的拙見，我學(xué)習(xí)了很久還是不得精髓，時間緊迫，還希望各位從事這方面研究的專業(yè)人士不啻賜教，在下感激不盡�。�！ |
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櫻空釋-懷
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【答案】應(yīng)助回帖
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1．準確度 該指標主要是通過回收率來反映。驗證時一般要求根據(jù)有關(guān)物質(zhì)的定量限與質(zhì)量標準中該雜質(zhì)的限度分別配制三個濃度的供試品溶液各三份（例如某雜質(zhì)的限度為0.2%，則可分別配制該雜質(zhì)濃度為0.1％、0.2％和0.3％的雜質(zhì)溶液），分別測定其含量,將實測值與理論值比較，計算回收率，并計算9個回收率數(shù)據(jù)的相對標準差（RSD）。 該項目的可接受的標準為：各濃度下的平均回收率均應(yīng)在80%-120%之間，如雜質(zhì)的濃度為定量限，則該濃度下的平均回收率可放寬至70%-130%，相對標準差應(yīng)不大于10%。 2．線性 線性一般通過線性回歸方程的形式來表示。具體的驗證方法為： 在定量限至一定的濃度范圍內(nèi)配制6份濃度不同的供試液，分別測定該雜質(zhì)峰的面積，計算相應(yīng)的含量。以含量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸分析。 可接受的標準為：回歸線的相關(guān)系數(shù)（R）不得小于0.990，Y軸截距應(yīng)在100％響應(yīng)值的25％以內(nèi)，響應(yīng)因子的相對標準差應(yīng)不大于10%。 3．精密度 1）重復(fù)性 配制6份雜質(zhì)濃度（一般為0.1%）相同的供試品溶液，由一個分析人員在盡可能相同的條件下進行測試，所得6份供試液含量的相對標準差應(yīng)不大于15%。 2）中間精密度 配制6份雜質(zhì)濃度（一般為0.1%）相同的供試品溶液，分別由兩個分析人員使用不同的儀器與試劑進行測試，所得12個含量數(shù)據(jù)的相對標準差應(yīng)不大于20%。 4．專屬性 可接受的標準為：空白對照應(yīng)無干擾，該雜質(zhì)峰與其它峰應(yīng)能完全分離，分離度不得小于2.0。 5．檢測限 雜質(zhì)峰與噪音峰信號的強度比應(yīng)不得小于3。 6．定量限 雜質(zhì)峰與噪音峰信號的強度比應(yīng)不得小于10。另外，配制6份最低定量限濃度的溶液，所測6份溶液雜質(zhì)峰保留時間的相對標準差應(yīng)不大于2.0%，峰面積的相對標準差應(yīng)不大于5.0%。 7．耐用性 分別考察流動相比例變化±5％、流動相pH值變化±0.2、柱溫變化±5℃、檢測波長變化±5nm、流速相對值變化±20％以及采用三根不同批號的色譜柱進行測定時，儀器色譜行為的變化，每個條件下各測試兩次。 可接受的標準為：各雜質(zhì)峰的拖尾因子不得大于2.0，雜質(zhì)峰與其他成分峰必須達到基線分離；各條件下的雜質(zhì)含量數(shù)據(jù)（n=6）的相對標準差應(yīng)不大于2.0%，雜質(zhì)含量的絕對值在±0.1％以內(nèi)。 8、系統(tǒng)適應(yīng)性 配制6份相同濃度的雜質(zhì)溶液進行分析，該雜質(zhì)峰峰面積的相對標準差應(yīng)不大于2.0%，保留時間的相對標準差應(yīng)不大于1.0%。另外，雜質(zhì)峰的拖尾因子不得大于2.0，理論塔板數(shù)應(yīng)符合質(zhì)量標準的規(guī)定。 9．溶液穩(wěn)定性 按照分析方法分別配置對照品溶液與供試品溶液，平行測定兩次主成分與雜質(zhì)的含量，然后將上述溶液分別貯存在室溫與冰箱冷藏室（4℃）中，在1、2、3、5和7天時分別平行測定兩次主成分與雜質(zhì)的含量。 可接受的標準為：主成分的含量變化的絕對值應(yīng)不大于2.0%，雜質(zhì)含量的絕對值在±0.1％以內(nèi)，并不得出現(xiàn)新的大于報告限度的雜質(zhì)。 我就按照這做的。 |
7樓2012-11-07 21:00:25
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【答案】應(yīng)助回帖
xiaohuibit: 回帖置頂 2012-06-10 04:24:43
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這個范圍就是你要檢測的樣品濃度的上下區(qū)間，比如50%~150%（你說的七個點就在這個范圍）。截距和斜率都沒用。至少在液相是沒用到。 2、檢測限是你檢測到的最低樣品濃度。它不需要重復(fù)測。一次就夠。 3、回收率做法是對的。但要做不同濃度的回收率，比如樣品濃度的，50%、80%、120%。三個濃度，每個做三次。RSD就是測得的九個結(jié)果的相對標準偏差。RSD是一個百分比。沒有單位。 4、精密度要單獨做，精密度可以同一個濃度重復(fù)測定6次，求得RSD。5、這個不知道。 另外給你附一分方法驗證的PDF，可以參考。 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=4546458 |
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xiaohuibit4樓2012-06-06 09:29:11
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