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songtuo1987新蟲 (初入文壇)
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[求助]
如何用DNS法測α-淀粉酶酶活
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| 請問各位大仙，有誰知道如何用DNS法測α-淀粉酶酶活嗎？小弟最近正愁這事呢，有人知道的話，教小弟具體步驟吧，急 |
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scelab: 金幣+5, MicEPI+1, 謝謝熱心交流~ 2012-06-10 18:13:13
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取1mL酶液于試管中，70℃保溫15min，迅速冷卻后，在40℃下預(yù)熱15min，然后加入2mL40℃預(yù)熱好的1%可溶性淀粉，搖勻后40℃下反應(yīng)5min，迅速冷卻并加入4mL0.4M氫氧化鈉終止反應(yīng)，然后取1mL反應(yīng)液于試管中，加入1mLDNS，沸水浴5min，迅速冷卻，定容至15mL，520nm下測定OD值。 參比：將酶液用氫氧化鈉滅活，然后加入淀粉，其他步驟相同。 空白：利用1mL蒸餾水代替1mL反應(yīng)液，其他步驟相同。 酶活力單位定義：上述條件下底物在1min催化生產(chǎn)1μmol還原糖的酶量定義為一個酶活力單位U（絕干）。 |
4樓2012-06-08 10:17:16
冼亮淀粉酶
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rainwander: 金幣+5, MicEPI+1, 鼓勵交流 2012-06-09 08:39:28
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我對這個方法有看法： 1、如果淀粉酶不能承受70度保溫15分鐘，就會失活，我不是空口無憑的，在這個條件下我的很多酶都會失活。 2、沒有提到緩沖系統(tǒng)，不能在酶的降解反應(yīng)中保持恒定pH值。 3、氫氧化鈉沒有和DNS配在一起成為一個試劑，多了一個單獨用來終止酶的降解的步驟。 4、“絕干”是什么意思？真菌固體培養(yǎng)所得到的曲？那么酶活力怎么算？再者，如果是真菌，操作多了之后孢子會飛。 |
5樓2012-06-09 04:35:08
冼亮淀粉酶
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【答案】應(yīng)助回帖
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scelab: 金幣+7, MicEPI+1, 謝謝熱心交流~ :) 2012-06-10 18:13:34
scelab: 金幣+7, MicEPI+1, 謝謝熱心交流~ :) 2012-06-10 18:13:34
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我覺得我用的方法步驟少，酶降解反應(yīng)所需體積小，便于大規(guī)模操作。 我用的DNS試劑配方如下（1L）： 四水合酒石酸鉀鈉200g，氫氧化鈉20g，無水亞硫酸鈉0.5g，結(jié)晶酚2g， DNS 10g，室溫避光靜置7天后可用。 我的操作步驟如下： 2.2.6.1.4淀粉酶活力的測定 （1）收集發(fā)酵上清液并作適當稀釋。 （2）在2mL EP管中加入350微升含1%可溶性淀粉的0.1M檸檬酸-0.2M磷酸氫二鈉緩沖液，在已調(diào)整至需要溫度的水浴鍋中預(yù)熱3min； （3）取淀粉酶粗酶液50微升加入至緩沖液中并混勻； （4）到達設(shè)定時間后，每管加0.8ml DNS試劑終止酶反應(yīng)； （5）沸水煮5 min后冷水冷卻，瞬時離心將附著在管壁上的液體甩下； （6）沸水煮5min的滅活上清液作同樣處理作為對照； （7）取200微升加到血清板上，測定540nm處光吸收值。 每次實驗設(shè)三個重復(fù)，酶活力定義：在測定的pH和溫度條件下，水解1%可溶性淀粉，每分鐘產(chǎn)生1微摩爾還原糖所需的酶量為一個酶活力單位。 至于干擾測定的酶，除了樓主所需要測定的3.2.1.1之外，還有樓上所提到想要70度滅活的3.2.1.2，還有3.2.1.3和3.2.1.10，它們降解淀粉的產(chǎn)物都是DNS法能測定的，都會干擾，DNS法不是專一的測定方法。我的很多真菌都能產(chǎn)3.2.1.1，最適作用溫度都低于50度，在70度放那么久是會失活的。 |
7樓2012-06-10 17:59:44
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scelab: 金幣+6, 謝謝熱心交流~ 2012-06-10 18:13:23
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顧問說的很有道理，可能由于每個人針對做的樣品不同可能有些誤差，就有些我略懂的東西簡單解釋下 1. α-淀粉酶是能經(jīng)受住70度溫度，此處利用70度15分鐘目的是為了使β-淀粉酶失活，因為有可能β淀粉酶水解淀粉釋放出的還原糖對結(jié)果造成影響（樣品中含β-淀粉酶）。 2.在提取酶液的時候用緩沖液提取的，所以沒提到。 3.DNS在配置過程中添加了氫氧化鈉，終止反應(yīng)時有時利用TCA或者氫氧化鈉，DNS我理解成顯色反應(yīng) 4.絕干是針對自己的試驗，不解釋了。 |
6樓2012-06-10 15:32:59
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