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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 細菌RNA提取
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lilirong2009銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
細菌RNA提取
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| 最近在提取大腸桿菌和化膿鏈球菌的RNA，取對數(shù)期3mL菌液于1.5mL離心后用DEPC水清洗一次，加Trizol之前用10mg/mL的溶菌酶處理10min，離心棄上清后加入1mLTrizol，激烈振蕩15 s，室溫靜置5 min； 每管加入 0.2 mL 的氯仿劇烈振蕩 15 s后室溫靜置 3 min；4℃, 12000 g, 離心 10 min；吸取上層400微升水相，轉入另一新的 1.5 mL 離心管， 加入等體積的異丙醇顛倒混勻；4℃，靜置 1 h；4℃，12000 g，離心 10 min。但是我離心后沒有看到任何沉淀，我還是按步驟操作，最后加10微升的DEPC水，然后跑了個瓊脂糖電泳，看到降解的5s條帶，為什么沒有沉淀呢？是溶菌酶沒有處理好還是靜置的時間不夠？后來我把菌液加大到8mL，做了加酶和不加酶處理，加異丙醇靜置1h離心，只有加酶處理的化膿鏈球菌有明顯沉淀，其它管仍沒有沉淀。實在困惑啊。 |
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7樓2012-06-10 10:26:19
fwks3518
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵應助 2012-06-09 13:44:27
感謝參與，應助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵應助 2012-06-09 13:44:27
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1、用DEPC水洗菌液沒必要，用普通緩沖液洗一下即可。 2、加trizol之前為了使菌體裂解充分，我們都是使用液氮研磨的方式來破碎細菌。況且細菌中的轉錄本半衰期大概只有3~8分鐘，你用溶菌酶處理的過程中，RNA的表達就發(fā)生了劇烈的變化，得到的RNA豐度已經不是你理想中的情況了。 3、提RNA過程中，離心管、手套、槍頭等等必須保證是無RNA酶的。 4、加入異丙醇靜置10min就夠了，不必1h 5、有時候，看不到沉淀不代表就沒有RNA（本人親身體會），測測OD260/280的數(shù)值就能估計到你所提RNA的量和純度了，但這些你在實驗里都沒有提及；如果跑電泳的電泳液不是現(xiàn)配的，在跑電泳過程中一樣會造成樣品降解，不代表你提的樣品不行。 6、據個人經驗，3ml的大腸桿菌的RNA已經可以提到mg級的總RNA了，所以你起始的菌體量已經足夠多了。如果菌體量太多，反而trizol相對不充分，使RNA提取有太多雜質。建議起始菌體量在1ml以下就可以了。 |
2樓2012-06-09 09:17:09
lilirong2009
銅蟲 (小有名氣)
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- 專業(yè): 人類營養(yǎng)
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我用1mL菌液并用帶離心柱試劑盒提取的時候濃度都是30-50ng/uL左右的，260/280=2.0，濃度很低沒法用，后來就改用Trizol提取，3mL提取的RNA因為沒有看到沉淀傷心之下就沒有測定濃度，跑電泳上樣2uL時亮度明顯但已經降解，不過我估計濃度也不會太高因為我才加了10uL的DEPC水溶解的。 用9mL的菌液提取的RNA樣，不加酶濃度為700ng/uL，加酶的濃度大約是不加酶的兩倍，260/280=1.76；可以看到沉淀的那管濃度5000ng/uL, 260/280=1.89。今天上午跑了電泳，圖1的左1是加酶看到沉淀的化膿鏈球菌，可以看到蛋白、DNA污染，RNA降解，我把曝光調低后的圖2顯示的RNA位置區(qū)域怎么有三條帶？左二不加酶處理也有蛋白污染，RNA降解；左三大腸桿菌加酶處理的降解得也差不多了。我都是吸取400uL的上清，而且是50uL吸的8次，怎么還那么明顯的DNA存在？如果我提取完RNA后加Dnase處理，還要用氯仿來萃取，會不會更降解了？ 圖1 左往右依次為鏈球菌+溶菌酶處理、鏈球菌、大腸桿菌+溶菌酶處理、大腸桿菌 圖2 和圖1一樣，只是曝光強調減小 |
3樓2012-06-09 10:57:16
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4樓2012-06-09 13:12:24
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