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plx2003cn新蟲 (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于WB的問題
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本人做的兩個月WB 最后都沒有想要的結(jié)果。明天打算從跑一次電泳 完整的再做一次看看。（本人大二，知識儲備不足，諒解....） 有幾個問題想問大家： 1.提取蛋白后（一共提了3份：①、②是轉(zhuǎn)染我要的質(zhì)粒后的細胞裂解蛋白，濃度分別是 3.3和3.8，③是未轉(zhuǎn)染直接提取的陰性對照，濃度很高，是5.2）........請問我上樣時 應(yīng)該加多少微升，導師說是上15微升 那是3個樣品保證質(zhì)量相同還是體積相同？ 2.蛋白提取了300微升 每次取100微升加20微升的β-巰基乙醇，沸水中煮8分鐘，請問β-巰基乙醇作用是什么 ，為什么要沸水煮。。。還有就是我每次取蛋白取完以后又把剩下的放進去 然后下次又取。。。這樣反復凍融對蛋白有沒有影響？ 做了兩個月了。。一開始是空白 啥都沒有 后來是非特異條帶特別亮 不管是陽性還是陰性，就是沒有要的目的條帶。感覺磚模和跑膠都不錯。昨天換了抗體 說明書上說的是1:3000- 1:8000都行 我用1:2000做了上周轉(zhuǎn)上的PVDF模，結(jié)果今天看了結(jié)果還是白版。。。無解了都…………只好今晚在從新跑膠………………   |
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plx2003cn
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2樓2012-06-20 22:12:09
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【答案】應(yīng)助回帖
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1.體積一致，若是對照各蛋白表達量差別那就量一致，用內(nèi)參校準。加樣20微升不是更好加嗎？！ 2.只用β-巰基乙醇不解，不知是你們實驗室的特殊配方還是怎么的，我們用SDS蛋白上樣buffer，本人感覺在這里SDS非常重要，因為它才是使蛋白帶負點進行有效的電泳和轉(zhuǎn)膜關(guān)鍵所在，不知有沒有檢查轉(zhuǎn)膜效率。β-巰基乙醇與二硫鍵的穩(wěn)定有關(guān)。反復凍融對蛋白影響很大，強烈建議分裝凍存使用。 |
3樓2012-06-20 22:45:11
peterozmo
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4樓2012-06-20 23:13:13
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