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zld629木蟲 (小有名氣)
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[求助]
平末端連接，連上了，很多轉(zhuǎn)化子中沒有一個(gè)正確的，怎么辦？
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| 在構(gòu)建一個(gè)載體到了最后一步平末端連接，總是不成功。轉(zhuǎn)化后長了不少菌，挑了100多那個(gè)，幾乎整板都挑了，沒有一個(gè)對的。怎么辦？我用載體上片段做正引物、插入片段末端做反引物，做PCR，連接液有很亮的帶，應(yīng)該是有連上的了，為什么轉(zhuǎn)化子中卻沒有？如何解決這個(gè)問題呢？ |
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syn1985
木蟲 (正式寫手)
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5樓2012-06-25 12:41:24
zld629
木蟲 (小有名氣)
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2樓2012-06-24 19:40:10
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助，很熱心哦 2012-06-25 13:44:46
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助，很熱心哦 2012-06-25 13:44:46
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有可能是把載體轉(zhuǎn)化進(jìn)去的那一步操作不好，溫度時(shí)間沒有控制好。 也有可能選的菌比較難轉(zhuǎn)化成功，畢竟轉(zhuǎn)化的成功率一般都低。 你可以這么試試，結(jié)合載體的類型和大小，選用另外一種公認(rèn)容易轉(zhuǎn)化成功的菌，試試能不能轉(zhuǎn)進(jìn)去。如果能轉(zhuǎn)進(jìn)去，說明你之前的菌較難轉(zhuǎn)化。如果不能轉(zhuǎn)進(jìn)去，說明載體其實(shí)沒有鏈接好或者操作過程有問題。 |
3樓2012-06-25 00:25:52
【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-06-25 13:44:56
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-06-25 13:44:56
| 先加A連接到t載體上，鑒定后酶切，再連接到目的載體上。實(shí)在不行試試In-Fusion克隆技術(shù)。http://wenku.baidu.com/view/5bb2f4a70029bd64783e2c60.html?st=1 |
4樓2012-06-25 11:25:27
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