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histoday新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
PCR擴(kuò)增融合基因
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| 新手：一個(gè)新的融合基因，想把它的全長(zhǎng)擴(kuò)出來(lái)，大約2000多kb,已經(jīng)試過(guò)很多次，都沒(méi)有結(jié)果。想聽(tīng)聽(tīng)大家的意見(jiàn)。比如用什么酶比較好？我用過(guò)普通taq酶，La taq酶，platinum，也重新設(shè)計(jì)過(guò)多次引物，但還是不行，想請(qǐng)教一下大家，謝謝！ |
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joan198108
鐵桿木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 很熱心的蟲(chóng)蟲(chóng)哦 2012-07-11 13:38:00
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 很熱心的蟲(chóng)蟲(chóng)哦 2012-07-11 13:38:00
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有幾個(gè)可能的原因： 1.酶的問(wèn)題，采用延伸能力比較強(qiáng)的酶 2.引物問(wèn)題，看看引物之間以及本身的配對(duì)堿基情況 3.模板問(wèn)題，GC含量高或者產(chǎn)生內(nèi)部形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，考慮使用GC buffer以及擴(kuò)增體系中加入甘油等物質(zhì) 4.退火溫度過(guò)低或者循環(huán)數(shù)偏少，提高退火溫度以及加大循環(huán)數(shù) |
9樓2012-07-09 08:41:20
beer胖
新蟲(chóng) (小有名氣)
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- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
2樓2012-07-07 17:09:26
histoday
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3樓2012-07-07 17:40:57
野草倚南墻
新蟲(chóng) (初入文壇)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-07-11 13:37:36
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-07-11 13:37:36
| 樓主給的信息很少，包括基因分析，gc含量也沒(méi)說(shuō)，沒(méi)擴(kuò)出來(lái)的圖是什么樣的也沒(méi)有，高gc要把退火溫度調(diào)高一些，如果平均gc在70%以上，建議你變性時(shí)間延長(zhǎng)，退火溫度用68度試一試。還可以在預(yù)變性結(jié)束后再加酶，確保酶不會(huì)應(yīng)為長(zhǎng)時(shí)間高溫而變性。 |
4樓2012-07-07 22:04:11
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