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[求助]
兼并引物的一些問題
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| 我設(shè)計了一對兼并引物，擴增出來和理論值長度相似的片段。但測序結(jié)果顯示并不是我想要的酶的基因片段，并且通過基因比對和自己當(dāng)初設(shè)計兼并引物時參考的菌的該酶的基因相似度就30%。請問還有需要做RACE,酶切，連接，轉(zhuǎn)化，表達·····的必要嗎？是否在此就該放棄，另找出路？ |
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2樓2012-07-12 18:22:16
3樓2012-07-15 10:52:57
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因為密碼子有簡并性，所以通常同一個基因的氨基酸序列相似性應(yīng)該會高于核酸序列吧。基因克隆我沒做過，我也不知道30％的氨基酸序列相似度是什么標(biāo)準(zhǔn)，如果比通常的基因克隆標(biāo)準(zhǔn)低的話，那lz你還是放棄然后重新P吧。 嗯，如果你有余力的話，可以試試把這段序列翻譯成核酸序列再去比對，說不定會有新發(fā)現(xiàn) 建議你找簡并性低的氨基酸序列設(shè)計簡并引物，以盡量減少引物的數(shù)量，甚至可以將一對簡并引物分成N對不同組成的引物（比如本來上游有4個簡并引物，下游有5個簡并引物，你可以分成4組，其中每組各有1個上游引物，下游依然是原來的5個），由于有效引物濃度太低或是形成引物二聚體等原因而導(dǎo)致簡并PCR失敗其實很正常，lz再多多嘗試吧。 |
4樓2012-07-15 12:08:19
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