hraikeyan

5樓: Originally posted by hyacinth326 at 2012-06-13 17:47:29
我感覺不用加，既然用兼并引物來p你應(yīng)該是不知道基因的序列吧，不知道基因的序列咋酶切��？不酶切就不用加保護(hù)堿基了啊，我覺得用兼并引物先把基因p下來然后連到載體上送測序確定基因的序列，再考慮酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿 ...

同意，還有一個(gè)問題想請教：我設(shè)計(jì)的引物上游引物20個(gè)堿基，下游17個(gè)。這個(gè)相差大嗎？還是說必須上下游要一樣？

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nothing isimpossible

6樓2012-06-13 19:12:20

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qbf1988226

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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流經(jīng)驗(yàn)，熱心的蟲蟲 2012-06-14 13:36:57

不用，只要Tm值相近就行，其他的按照引物設(shè)計(jì)一般性原則
(1)長度：15—30bp，其有效長度[Ln＝2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否則PCR的最適延伸溫度會(huì)超過Taq酶的最佳作用溫度(74度)，從而降低產(chǎn)物的特異性。
(2)G十c含量：應(yīng)在45％一55％之間，PCR擴(kuò)增中的復(fù)性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5—10度。引物長度小于20時(shí)，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。
(3)堿基分布的隨機(jī)性：應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個(gè)以上的單一堿基。尤其是不應(yīng)在其3’端出現(xiàn)超過3個(gè)的連續(xù)G或C，否則會(huì)使引物在G十C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。
(4)引物自身：不能含有自身互補(bǔ)序列，否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)。
(5)引物之間：兩個(gè)引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)的互補(bǔ)或同源堿基，不然會(huì)形成引物二聚體，尤應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。
特異性：與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于70％，或少于連續(xù)8個(gè)的互補(bǔ)堿基。
2．引物的3’端：引物的3’端很人程度上影響Taq酶的延伸效應(yīng)，除特殊情況(AS－PCR)外，3’端不應(yīng)發(fā)生錯(cuò)配。S.Kwok等發(fā)現(xiàn)，引物的3’端發(fā)生錯(cuò)配時(shí)，A：A使產(chǎn)量下降至l／20，A：G或C：C下降至1／100。當(dāng)末位堿基是T時(shí)，即使錯(cuò)配也能引發(fā)鏈的合成，而為A時(shí)錯(cuò)配的引發(fā)效率最低，G、C居間。因此，引物的3’端堿基最好選用A、G、C，而盡可能地避免選用T，尤應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)2個(gè)以上的T。
此外，如果擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物的3’端不要終止于密碼了的第3位，因此處易發(fā)牛簡并，從而影響擴(kuò)增持異性。
3．避開引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)：某些引物無效的原因是引物重復(fù)區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，因此選擇擴(kuò)增片段時(shí)應(yīng)注意避開二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)，有些計(jì)算機(jī)軟件可幫助確定該區(qū)域，如不能避開，則可用7－deaza－2’－脫氧GTP取代‘dGTP，有助干PCR成功。

很多時(shí)候不能完全符合上述的條件，用一些設(shè)計(jì)引物的軟件來進(jìn)行設(shè)計(jì)檢查。我的感覺是大概就行，基本都能擴(kuò)的出來

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7樓2012-06-13 21:34:15

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hyacinth326

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【答案】應(yīng)助回帖

沒必要考慮上下游引物堿基數(shù)，只要Tm值相近就可以了

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8樓2012-06-13 22:02:28

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