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兼并引物的一些問(wèn)題
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| 我設(shè)計(jì)了一對(duì)兼并引物，擴(kuò)增出來(lái)和理論值長(zhǎng)度相似的片段。但測(cè)序結(jié)果顯示并不是我想要的酶的基因片段，并且通過(guò)基因比對(duì)和自己當(dāng)初設(shè)計(jì)兼并引物時(shí)參考的菌的該酶的基因相似度就30%。請(qǐng)問(wèn)還有需要做RACE,酶切，連接，轉(zhuǎn)化，表達(dá)·····的必要嗎？是否在此就該放棄，另找出路？ |
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2樓2012-07-12 18:22:16
3樓2012-07-15 10:52:57
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因?yàn)槊艽a子有簡(jiǎn)并性，所以通常同一個(gè)基因的氨基酸序列相似性應(yīng)該會(huì)高于核酸序列吧�；蚩寺∥覜](méi)做過(guò)，我也不知道30％的氨基酸序列相似度是什么標(biāo)準(zhǔn)，如果比通常的基因克隆標(biāo)準(zhǔn)低的話，那lz你還是放棄然后重新P吧。 嗯，如果你有余力的話，可以試試把這段序列翻譯成核酸序列再去比對(duì)，說(shuō)不定會(huì)有新發(fā)現(xiàn) 建議你找簡(jiǎn)并性低的氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以盡量減少引物的數(shù)量，甚至可以將一對(duì)簡(jiǎn)并引物分成N對(duì)不同組成的引物（比如本來(lái)上游有4個(gè)簡(jiǎn)并引物，下游有5個(gè)簡(jiǎn)并引物，你可以分成4組，其中每組各有1個(gè)上游引物，下游依然是原來(lái)的5個(gè)），由于有效引物濃度太低或是形成引物二聚體等原因而導(dǎo)致簡(jiǎn)并PCR失敗其實(shí)很正常，lz再多多嘗試吧。 |
4樓2012-07-15 12:08:19
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