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楊文心木蟲 (小有名氣)
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[求助]
請教硫酸咔唑法測糖含量中的原理以及換算因素？
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各位蟲友，請教大家一個問題，我最近要用到硫酸咔唑法測一個酸性多糖的糖含量，對于這個方法的原理以及計算方法有些不明白，希望能得到各位賜教。 1.原理問題 我查看文獻(xiàn)有其原理有兩種說法，一說是多糖在硫酸作用下水解成含糖醛酸結(jié)構(gòu)的單糖，然后糖醛酸與咔唑反應(yīng)生成紫紅色的化合物，其在~530nm處有吸收，可通過紫外分光光度計測其吸收值，進(jìn)而計算多糖含量。 另一說法是多糖在硫酸作用下先水解成單糖，單糖再次分解成糠醛，糠醛與咔唑反應(yīng)生成紫紅色的化合物，其在~530nm處有吸收，可通過紫外分光光度計測其吸收值，進(jìn)而計算多糖含量。 對于其原理，不知哪種說法是準(zhǔn)確的，希望有懂這個的可以告知一聲。 2.換算因素問題 在用硫酸咔唑法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時，文獻(xiàn)多用的是葡萄糖醛酸溶液而非純的多糖當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品，但是供試品卻是多糖，這中間應(yīng)該存在一個換算因素F，可是這個換算因素F的計算，并沒有查到哪篇文獻(xiàn)講得很清楚，個人理解是，用硫酸咔唑法測多糖吸光度A530nm，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的結(jié)果應(yīng)該是葡萄糖醛酸的含量，再除以葡萄糖醛酸占多糖中的質(zhì)量比即是多糖的含量，不知我的理解是否正確？ 舉例：如我要測一個多糖heparosan的含量（結(jié)構(gòu)見下圖），文獻(xiàn)報道其二糖分子量為392.9，已知葡萄糖醛酸的分子量為194.14那么它的換算因素 F=1/(194.14/392.9)，不知道我的算法是否正確，求指教！ Repeating disaccharide unit of heparosan |
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中國華夏
銅蟲 (初入文壇)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
xiaoxiao270: 金幣+2, 3Q 2012-07-12 20:47:57
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xiaoxiao270: 金幣+2, 3Q 2012-07-12 20:47:57
| 我覺得是偏向第二種原理，水解成單糖的同時被硫酸氧化成糠醛，糠醛再和咔唑綜合成有色物質(zhì)，這種綜合類似于酚醛綜合。對于換算因子，覺得不是你說的那樣，試想，如果是你說的那樣，如果測定多糖的濃度如果不知道分子量那豈不是測不出來了？所以在這里，可以看原理，既然原理都說已經(jīng)水解成單糖了，那你的供試品就算不是單糖也變成了單糖，只是有些糖水解后的單糖不只是葡萄糖或是別的單糖，至于不同的單糖氧化后再綜合成有色物質(zhì)，這里的差別沒有考查過，但我想差別不大。 |
2樓2012-07-11 21:49:20
楊文心
木蟲 (小有名氣)
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有一個疑惑，問一下硫酸-苯酚法和硫酸-咔唑法測糖含量的區(qū)別？ 文獻(xiàn)報道說硫酸-苯酚法是測總糖含量，也即酸性+中性+堿性糖 含量，而硫酸-咔唑法測得是酸性糖的含量，不知道具體反映在原理上是什么區(qū)別？ 我有一個猜想是，酸性糖中有糖醛酸結(jié)構(gòu)，用硫酸-咔唑法測的時候酸性多糖在濃硫酸作用下水解成帶有糖醛酸結(jié)構(gòu)的糠醛，此糠醛能與咔唑反應(yīng)生成紫紅色化合物而顯色，如果是這個原理的話，那么多糖中其它不含糖醛酸結(jié)構(gòu)的糖類在這個分析中是不反應(yīng)出來的，也即硫酸咔唑法只測多糖中的酸性糖部分。因而，同樣的多糖，用硫酸-苯酚法測出來的結(jié)果往往會比用硫酸-咔唑法測出來的結(jié)果偏大些。 這個猜想中也有一個比較模糊的地方不太清楚，就是所謂只測酸性糖部分，是指多糖中的酸性多糖部分結(jié)構(gòu)里面的具體酸性單糖成分，還是指多糖中有酸性多糖和中性多糖，但是測的是酸性多糖整體�；氐轿疑厦婺莻�多糖結(jié)構(gòu)來說，也即硫酸-咔唑法測得是那個結(jié)構(gòu)片段里面的左半部分，還是整體的。這是有區(qū)別的。 至于你說的兩部分在硫酸作用下最后都水解成了糠醛，應(yīng)該是測的整體的糖含量，但是我覺得有一個可能性是水解生產(chǎn)的糠醛部分中那個-R基團(tuán)可能不太一樣，左半部分糠醛上的-R基團(tuán)可能帶有-COOH，而右半部分糠醛上的-R基團(tuán)上沒有-COOH，因而可能真正與咔唑起顏色反應(yīng)的只有帶-COOH部分的那個糖 ，也即硫酸-咔唑法測得的結(jié)果應(yīng)該是該多糖中的葡萄糖醛酸部分而不是整個多糖的含量了，那么整個多糖的含量實際上應(yīng)該比測得值更大，也即是測得的糖醛酸的含量除于糖醛酸占多糖中的比例。 當(dāng)然，如果是另外一種情況的話，也即酸性糖整體都參與了反應(yīng)，跟帶不帶-COOH無關(guān)的話，那么酸性多糖的含量就可以粗略的近似等于所測得的葡萄糖醛酸的含量了。 呵呵…我也不知到哪種可能是正確的，猜測而已。 |
3樓2012-07-12 19:21:54
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