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[求助]
有關(guān)糖代謝酶，誰(shuí)做過(guò)，請(qǐng)幫我想想解決的辦法，急，謝謝 已有1人參與
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SPS活性測(cè)定參照Komatsu等、Lowell等、Hubbard等和陳俊偉的方法，并加以改進(jìn)。在80μl 反應(yīng)體系中含 50mmol/L Hepes一NaoH緩沖液 (pH7.5),15mmol/LMgcl2，1mmol/L一1EDTA,5mmol/L NaF，10mmol/L UDPG,4mmol/L F一6一P,20mmol/L G一6一P，酶提取液;300C反應(yīng) 30min，然后加入60μl 5mol/LNaOH終止反應(yīng)，最后沸水浴 10min，冷卻后加入1ml 0.14%的蒽酮(溶解在13.8mol/L 的H2SO4中，即0.14g蒽酮溶解在76ml H2SO4 +30ml水中)400C反應(yīng)20min,測(cè)定A620。對(duì)照反應(yīng)體系中不含F(xiàn)ru 6-P和Glc 6-P。。酶活力以單位鮮果重中的酶在單位時(shí)間內(nèi)催化底物生成蔗糖的μmol數(shù)表示。單位為：μmol．h-1．g-1FW(FW指果實(shí)鮮重)。 SS合成方向的活性測(cè)定參照Lowell等、Hubbard等和陳俊偉的方法，并加以改進(jìn)。在60μl反應(yīng)體系中含 80mmol/LHpes一NaoH緩沖液 (pH7.5),5mmol/L KCN, 5mmol/L NaF,100mmol/L 果糖，10mmol/L UDPG，酶提取液;300C應(yīng) 30min，加入60 μl 5mmol/LNaoH終止反應(yīng)，沸水浴 10min，冷卻后加入1ml 0.14%的蒽酮(溶解在13.8mol/L 的H2SO4，中，即0.14g蒽酮溶解在76ml H2SO4 +30ml水中)400C反應(yīng)20min,測(cè)定A620。對(duì)照反應(yīng)體系中不含果糖。酶活力以單位鮮果重中的酶液在單位時(shí)間內(nèi)催化底物生成蔗糖的μmol數(shù)表示。單位為：μmol．h-1．g-1．FW(FW指果實(shí)鮮重)。 SS分解方向的活性測(cè)定參考Lowell等和陳俊偉的方法。在490μl反應(yīng)體系中含80 mmol/L Mes緩沖液(pH 5．5)，(5mmol/L NaF,100mmol/L蔗糖， 5mmol/LUDP)，酶提取液;300C反應(yīng) 30min，加入490μlDNS(稱(chēng)6.3g 3，5一二硝基水揚(yáng)酸溶解于水中，加2.1g NaOH和185g酒石酸鉀鈉后，加水(煮沸十分鐘后冷卻密封)500mL，加熱溶解后，加重蒸酚5g，無(wú)水亞硫酸鈉 5g，加熱攪拌，冷卻后定容至1000mL，貯存于棕色瓶中，放置一周之后使用)試劑終止反應(yīng)，沸水浴 5min，冷卻后測(cè)定A540。對(duì)照反應(yīng)體系中不含UDP. 酶活力以單位鮮果重中的酶液在單位時(shí)間內(nèi)催化底物生成蔗糖的μmol數(shù)表示。單位為：μmol．h-1．g-1．FW(FW指果實(shí)鮮重)。 酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)和中性轉(zhuǎn)化酶(NI)的測(cè)定按照Merlo和Passera(1991)的方法，略有改動(dòng)。反應(yīng)液總體積為l ml，包括：o．1 mol /L乙酸鈉-乙酸(pH 4．8，對(duì)酸性轉(zhuǎn)化酶)或O．1 mol /L磷酸氫二鉀,0．1 mol /L檸檬酸鈉-檸檬酸(pH 7．2，對(duì)中性轉(zhuǎn)化酶)，0．1 mol /L蔗糖和O．1 ml酶液。在370C保溫40 min后，加1 ml 3，5-二硝基水楊酸試劑終止反應(yīng)，準(zhǔn)確煮沸5 min，冷卻，測(cè)定A520，即測(cè)定從蔗糖釋放還原糖的量。用酶空白作對(duì)照，底物空白用參比。酶空白只含有酶液和反應(yīng)液，不含底物：底物空白只含有底物和反應(yīng)液，不含酶液，其它步驟相同。 這是我的方法，但是我做出來(lái)不對(duì)。 1; 我用上面的蒽酮比色法做蔗糖的標(biāo)曲，加入我配好的0.14%的蒽酮(溶解在13.8mol/L 的H2SO4，中，即0.14g蒽酮溶解在76ml H2SO4 +30ml水中）之后，蔗糖溶液全部產(chǎn)生乳白色的絮狀物，不知道到底是什么原因 2, 我用dns法做葡萄糖標(biāo)曲時(shí)，葡萄糖濃度為500微克每毫升開(kāi)始煮沸后后冷卻就產(chǎn)生絮狀物，加熱又會(huì)溶解，完全在書(shū)上坐標(biāo)曲的濃度范圍之內(nèi)，不知道這是咋咋回事 3， 我測(cè)酶活性時(shí)空白里不加每，只加底物和反應(yīng)液，應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題吧，但是測(cè)出來(lái)的數(shù)據(jù)還是有問(wèn)題，請(qǐng)指點(diǎn) 非常感謝 |
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3樓2012-07-16 13:55:22
2樓2012-07-12 09:36:28
zqm851015
鐵蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 31
- 帖子: 16
- 在線: 13.5小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 701970
- 注冊(cè): 2009-02-16
- 專(zhuān)業(yè): 果樹(shù)學(xué)
4樓2012-07-19 17:11:54
5樓2012-07-20 22:30:29
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