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sjjsy7銀蟲 (小有名氣)
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關(guān)于PFU酶擴(kuò)增
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最近用PFU酶想克隆幾個(gè)水稻基因，可是死活擴(kuò)不出，先說(shuō)一下我的體系吧 25ul體系 dd水14.75ul 10X PFU Buffer2.5ul dNTP1ul 引物0.5ul PFU酶0.3ul temp 1ul 退火溫度55度，延伸2分鐘 最后跑膠的時(shí)候連引物二聚體也沒(méi)有，是不是引物不行啊，還有就是我下一步是接T載體，有人跟我說(shuō)用PFU擴(kuò)最后還得另外加A尾巴，Taq酶不用，到底是個(gè)什么情況？  還請(qǐng)哪位蟲蟲指點(diǎn)迷津�。。。。。。�！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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amisking: 金幣+4, 鼓勵(lì)發(fā)帖幫助解答問(wèn)題。 2012-07-17 21:03:16
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amisking: 金幣+4, 鼓勵(lì)發(fā)帖幫助解答問(wèn)題。 2012-07-17 21:03:16
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Taq酶最后會(huì)給擴(kuò)增產(chǎn)物加個(gè)A，之后正好可以用于T-A載體的連接。 PFU酶擴(kuò)增的是你純粹的產(chǎn)物，你可以再引物設(shè)計(jì)的時(shí)候給帶上個(gè)AT之類的（建議再去查一下，我也是知道理論，具體做起來(lái)還是要搞得清楚些，少走彎路）。 但是跑膠沒(méi)有跑出來(lái)的話，只能說(shuō)明沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái)，這個(gè)可能性就大了。 比如，你確定你的模版里，這個(gè)基因是表達(dá)的？你的酶沒(méi)有失活？需要加鎂離子嗎（沒(méi)用過(guò)，不確定）？ |
2樓2012-07-17 19:19:49
ximenzoe
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3樓2012-07-18 08:48:33
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4樓2012-07-18 10:14:24
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【答案】應(yīng)助回帖
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高保真就是這樣不易產(chǎn)生引物二聚體，現(xiàn)在你的問(wèn)題是怎么擴(kuò)出條帶對(duì)吧。 1.你的Buffer含鎂離子嗎？ 2.你只試了55攝氏度，你可以做個(gè)溫度梯度。 3.你跑個(gè)內(nèi)參看看是不是模板問(wèn)題。 如果這些都試了還沒(méi)帶，那可能是你的引物問(wèn)題。 |
5樓2012-07-18 11:07:22
genegop
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7樓2012-07-18 12:41:46
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9樓2012-07-18 12:45:10
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10樓2012-07-18 12:47:47
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