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16S rDNA測(cè)序問題 已有2人參與
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各位前輩，我想請(qǐng)教一下16S rDNA測(cè)序問題。我要鑒定一個(gè)未知菌，用試劑盒提基因組DNA，然后用通用引物PCR，在1500bp處有很亮的條帶，又將PCR產(chǎn)物割膠純化，然后送去測(cè)序，測(cè)了兩次都沒測(cè)通。測(cè)序公司給了我一下三個(gè)可能性。 1.已純化的PCR樣品造成這種情況的原因是由于模板純化有一定問題，模板中含有非特異性的條帶； 2.如果是未純化的PCR產(chǎn)物，那么有可能是您要求測(cè)序的片段周圍含有大小相近的條帶，我們通過瓊脂糖凝膠回收，無法有效切除這種大小差別不是很明顯的條帶； 3.模板或是引物質(zhì)量較差，測(cè)序反應(yīng)結(jié)束之后沒有產(chǎn)生足夠的目的產(chǎn)物，導(dǎo)致測(cè)序信號(hào)較弱，雜背景較高，形成重疊現(xiàn)象。 我看了一些文獻(xiàn)，好多就是直接把PCR產(chǎn)物測(cè)序，我這個(gè)也有條帶啊，怎么就測(cè)不出來呢？我懷疑是我的菌不夠純，都劃線6次以上了。請(qǐng)各位前輩們看看我這問題出在哪里了？ 還有，對(duì)于鑒定菌我一直迷茫是先做生理生化鑒定還是先做16S鑒定，做生理生化鑒定我不知道該做哪些指標(biāo)。。。 |
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