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nnbj新蟲 (初入文壇)
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[求助]
正反向測(cè)序問題 已有1人參與
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本人最近將一外源片段和質(zhì)粒利用EcoRV與MluI酶切后連接，挑去單克隆進(jìn)行測(cè)序。分別設(shè)計(jì)正反向引物，反向引物測(cè)序結(jié)果顯示目的基因后半部分正確，正向引物測(cè)序結(jié)果很亂（發(fā)現(xiàn)將正向引物測(cè)序結(jié)果和反向測(cè)序結(jié)果align后，這兩個(gè)測(cè)序序列基本相同，將兩個(gè)序列結(jié)果assemble測(cè)序顯示目的基因后半部分正確，故得不到前半部分結(jié)果）。第一次懷疑引物設(shè)計(jì)出現(xiàn)問題，第二次利用T7通用引物再次正向測(cè)，結(jié)果同第一次。不知道問題出現(xiàn)在了哪里？ 求高手指教。 [ Last edited by nnbj on 2014-1-3 at 20:11 ] |
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cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2014-01-06 09:51:53
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測(cè)序通常采用載體上的通用引物。用自己設(shè)計(jì)的目的基因特異引物會(huì)有一小段靠近引物的序列測(cè)不出來(lái)。 如果你克隆的片段小于700bp，完全可以用一個(gè)反應(yīng)測(cè)，隨便哪個(gè)方向都可以的。如果克隆片段在700-1400bp之間，需要用正反向引物才能測(cè)通。如果比1400bp大，需要在中間設(shè)計(jì)基因特異引物。 |
2樓2014-01-04 04:03:16
nnbj
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5樓2015-04-30 15:35:35
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