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cexoihtydx金蟲 (正式寫手)
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[求助]
求嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的詳細步驟
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欲使用嘌呤霉素抗性篩選細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，求 1. 確定細胞最適的嘌呤霉素濃度范圍的實驗步驟 2. 做轉(zhuǎn)染時的嘌呤霉素篩選步驟 新手，非常感謝！ |
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2樓2012-11-01 21:48:49
肖穎2009
鐵蟲 (正式寫手)
- 應助: 36 (小學生)
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- 蟲號: 945732
- 注冊: 2010-01-20
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物物理、生物化學與分子
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哺乳動物細胞 嘌呤霉素在哺乳動物細胞系反應中的有效濃度范圍從1-10μg/ml。實驗初始，我們建議， 決定實驗中抗生素的最適濃度的方法是首先該濃度可以殺死自身宿主細胞系。 嘌呤霉素可以迅速消滅不含有pac基因的真核細胞。死亡細胞從平板分離，該平板可以用于簡單和初期的轉(zhuǎn)化克隆細胞鑒定。建議篩選哺乳動物細胞的最適濃度應當?shù)陀谒袧舛戎怠? 哺乳動物細胞篩選方法 嘌呤霉素常用濃度范圍在1 - 10 μg/ml。等轉(zhuǎn)化出含有pac基因的質(zhì)粒后，細胞在含有嘌呤霉 素的普通培養(yǎng)基中增殖，以篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。 1. 在轉(zhuǎn)染的48小時內(nèi)，將細胞（原樣或稀釋）置于含有適當濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 注意：細胞在快速增殖時，抗生素作用最明顯。如果細胞濃度過大，抗生素產(chǎn)生的效力也會下 降。細胞最好在他們?nèi)诤下什桓哂?5%時分裂最佳。 2.每隔3-4天，移除和更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。 3.篩選7天后評估細胞形成的病灶。病灶可能需要額外的一周或者更多時間，這依賴于宿 主細胞系和轉(zhuǎn)染篩選效率。 4.轉(zhuǎn)移和放置5-10個抗性克隆到一個35mm的培養(yǎng)皿中，用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)7天。這次 富集培養(yǎng)是為日后的細胞毒性實驗做準備。 |
3樓2013-02-06 14:29:54
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抗生素篩選穩(wěn)定細胞株流程 1. 提前一天接種細胞與24孔板中，待第二天長成25%單層為宜，二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃過夜培養(yǎng)； 2. 第二天將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增； 3. 培養(yǎng)7-10天左右絕大多數(shù)細胞死亡抗生素濃度為準，篩選細胞時刻適當提高濃度； 4. 二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72h后按照1:10的比例將轉(zhuǎn)染細胞傳代，使用預實驗得到的抗生素濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)。后挑選單克隆，有限稀釋法挑取單克隆。 5. Western blot或ELISA檢測蛋白的表達情況，挑取多個單克隆進行表達檢測，篩選出表達量最高的克隆傳代并保存。最終進行穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選 |
4樓2018-04-20 09:24:17
5樓2018-04-20 09:30:15
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