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cexoihtydx金蟲 (正式寫手)
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[求助]
求嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的詳細(xì)步驟
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欲使用嘌呤霉素抗性篩選細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，求 1. 確定細(xì)胞最適的嘌呤霉素濃度范圍的實驗步驟 2. 做轉(zhuǎn)染時的嘌呤霉素篩選步驟 新手，非常感謝！ |
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2樓2012-11-01 21:48:49
肖穎2009
鐵蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 36 (小學(xué)生)
- 金幣: 1068.4
- 散金: 35
- 紅花: 8
- 帖子: 665
- 在線: 147.7小時
- 蟲號: 945732
- 注冊: 2010-01-20
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
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哺乳動物細(xì)胞 嘌呤霉素在哺乳動物細(xì)胞系反應(yīng)中的有效濃度范圍從1-10μg/ml。實驗初始，我們建議， 決定實驗中抗生素的最適濃度的方法是首先該濃度可以殺死自身宿主細(xì)胞系。 嘌呤霉素可以迅速消滅不含有pac基因的真核細(xì)胞。死亡細(xì)胞從平板分離，該平板可以用于簡單和初期的轉(zhuǎn)化克隆細(xì)胞鑒定。建議篩選哺乳動物細(xì)胞的最適濃度應(yīng)當(dāng)?shù)陀谒袧舛戎怠? 哺乳動物細(xì)胞篩選方法 嘌呤霉素常用濃度范圍在1 - 10 μg/ml。等轉(zhuǎn)化出含有pac基因的質(zhì)粒后，細(xì)胞在含有嘌呤霉 素的普通培養(yǎng)基中增殖，以篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。 1. 在轉(zhuǎn)染的48小時內(nèi)，將細(xì)胞（原樣或稀釋）置于含有適當(dāng)濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 注意：細(xì)胞在快速增殖時，抗生素作用最明顯。如果細(xì)胞濃度過大，抗生素產(chǎn)生的效力也會下 降。細(xì)胞最好在他們?nèi)诤下什桓哂?5%時分裂最佳。 2.每隔3-4天，移除和更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。 3.篩選7天后評估細(xì)胞形成的病灶。病灶可能需要額外的一周或者更多時間，這依賴于宿 主細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染篩選效率。 4.轉(zhuǎn)移和放置5-10個抗性克隆到一個35mm的培養(yǎng)皿中，用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)7天。這次 富集培養(yǎng)是為日后的細(xì)胞毒性實驗做準(zhǔn)備。 |
3樓2013-02-06 14:29:54
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抗生素篩選穩(wěn)定細(xì)胞株流程 1. 提前一天接種細(xì)胞與24孔板中，待第二天長成25%單層為宜，二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃過夜培養(yǎng)； 2. 第二天將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增； 3. 培養(yǎng)7-10天左右絕大多數(shù)細(xì)胞死亡抗生素濃度為準(zhǔn)，篩選細(xì)胞時刻適當(dāng)提高濃度； 4. 二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72h后按照1:10的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代，使用預(yù)實驗得到的抗生素濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)。后挑選單克隆，有限稀釋法挑取單克隆。 5. Western blot或ELISA檢測蛋白的表達(dá)情況，挑取多個單克隆進(jìn)行表達(dá)檢測，篩選出表達(dá)量最高的克隆傳代并保存。最終進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選 |
4樓2018-04-20 09:24:17
5樓2018-04-20 09:30:15
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