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cexoihtydx金蟲 (正式寫手)
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[求助]
求嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的詳細(xì)步驟
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欲使用嘌呤霉素抗性篩選細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，求 1. 確定細(xì)胞最適的嘌呤霉素濃度范圍的實(shí)驗(yàn)步驟 2. 做轉(zhuǎn)染時(shí)的嘌呤霉素篩選步驟 新手，非常感謝！ |
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2樓2012-11-01 21:48:49
肖穎2009
鐵蟲 (正式寫手)
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- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
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哺乳動(dòng)物細(xì)胞 嘌呤霉素在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系反應(yīng)中的有效濃度范圍從1-10μg/ml。實(shí)驗(yàn)初始，我們建議， 決定實(shí)驗(yàn)中抗生素的最適濃度的方法是首先該濃度可以殺死自身宿主細(xì)胞系。 嘌呤霉素可以迅速消滅不含有pac基因的真核細(xì)胞。死亡細(xì)胞從平板分離，該平板可以用于簡單和初期的轉(zhuǎn)化克隆細(xì)胞鑒定。建議篩選哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最適濃度應(yīng)當(dāng)?shù)陀谒袧舛戎怠? 哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選方法 嘌呤霉素常用濃度范圍在1 - 10 μg/ml。等轉(zhuǎn)化出含有pac基因的質(zhì)粒后，細(xì)胞在含有嘌呤霉 素的普通培養(yǎng)基中增殖，以篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。 1. 在轉(zhuǎn)染的48小時(shí)內(nèi)，將細(xì)胞（原樣或稀釋）置于含有適當(dāng)濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 注意：細(xì)胞在快速增殖時(shí)，抗生素作用最明顯。如果細(xì)胞濃度過大，抗生素產(chǎn)生的效力也會(huì)下 降。細(xì)胞最好在他們?nèi)诤下什桓哂?5%時(shí)分裂最佳。 2.每隔3-4天，移除和更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。 3.篩選7天后評(píng)估細(xì)胞形成的病灶。病灶可能需要額外的一周或者更多時(shí)間，這依賴于宿 主細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染篩選效率。 4.轉(zhuǎn)移和放置5-10個(gè)抗性克隆到一個(gè)35mm的培養(yǎng)皿中，用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)7天。這次 富集培養(yǎng)是為日后的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。 |
3樓2013-02-06 14:29:54
蘿卜漲價(jià)了 
銅蟲 (初入文壇)
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抗生素篩選穩(wěn)定細(xì)胞株流程 1. 提前一天接種細(xì)胞與24孔板中，待第二天長成25%單層為宜，二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃過夜培養(yǎng)； 2. 第二天將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增； 3. 培養(yǎng)7-10天左右絕大多數(shù)細(xì)胞死亡抗生素濃度為準(zhǔn)，篩選細(xì)胞時(shí)刻適當(dāng)提高濃度； 4. 二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72h后按照1:10的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代，使用預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的抗生素濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)。后挑選單克隆，有限稀釋法挑取單克隆。 5. Western blot或ELISA檢測蛋白的表達(dá)情況，挑取多個(gè)單克隆進(jìn)行表達(dá)檢測，篩選出表達(dá)量最高的克隆傳代并保存。最終進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選 |
4樓2018-04-20 09:24:17
蘿卜漲價(jià)了
銅蟲 (初入文壇)
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5樓2018-04-20 09:30:15
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