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RACE的引物設(shè)計(jì)問(wèn)題
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| 鄙人要擴(kuò)增一個(gè)基因全長(zhǎng)，目前已將中間片段擴(kuò)增出來(lái)了，結(jié)果如下：ATGAGTCTTAGAGGACTGGGTGTAGATCCACGCTGTCGCTGCATTGAAACTGAGAGTCGACGCATTGGAAAACACATAGAGAGTGTGGAGCTCTTCCCTCCAAACTCACACTGTAAAGACACAGAGATCATTGCAACCCTGAAGATAACTGGGAAAGAGATCTGTCTGGACCCTACTGCACCCTGGGTTAAGAAAGTCAT 。請(qǐng)問(wèn)各位大俠，如何根據(jù)這個(gè)中間片段設(shè)計(jì)3‘RACE和5’RACE引物，進(jìn)行3‘RACE和5’RACE擴(kuò)增？ |
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free_zi
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2樓2012-07-21 18:12:05
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yananhl
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4樓2012-07-22 19:44:57
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)積極分享經(jīng)驗(yàn) 2012-07-23 15:46:36
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)積極分享經(jīng)驗(yàn) 2012-07-23 15:46:36
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正好最近也在做，和lz分享一下經(jīng)驗(yàn)吧。 1、長(zhǎng)度大概23-28nt。不用太長(zhǎng)，沒(méi)啥用。 2、高tm，盡量tm值高于65度，能上70也行，便于后邊使用降落PCR。 3、gc含量盡量接近50或更高。 4、推薦使用pp5和oligo6，前者搜索，后者檢測(cè)，雖然tm值相差會(huì)很大（pp5計(jì)算方法不如oligo精細(xì)），但無(wú)傷大雅。 5、也可手動(dòng)設(shè)計(jì)，就是單用oligo，尋找tm較高的區(qū)域，手動(dòng)調(diào)整。 6、如果片段較短，建議先進(jìn)行3’，相對(duì)簡(jiǎn)單。之后得到3‘片段了，再在拼接起來(lái)的長(zhǎng)片段上設(shè)計(jì)5’GSP。原因是5‘一般用試劑盒，對(duì)引物要求較高，尤其是用TAKARA的，如果引物設(shè)計(jì)不好，就是燒錢(qián)，片段長(zhǎng)點(diǎn)，引物設(shè)計(jì)的選擇余地就大。 望對(duì)lz有用！ |
6樓2012-07-23 09:40:05
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7樓2012-07-25 11:27:58
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8樓2012-07-25 11:33:07
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