 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 860 | 回復(fù): 14 | ||
[求助]
原核載體構(gòu)建
|
|
求助： 我現(xiàn)在在構(gòu)建一個原核載體，是氯霉素抗性的，我用的是KpnI,XbaI這兩個酶，我一直用的傳統(tǒng)的方法，可就是連不上，PCR回收在酶切，質(zhì)粒酶切，單酶切，都試過了，就是連不上，請問高手們，有沒有遇到過這樣的問題啊1 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有111人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- pEASY-E1使用中出現(xiàn)的問題
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 原核表達(dá)載體構(gòu)建，測序不成功
已經(jīng)有20人回復(fù)
- 真核表達(dá)載體 原核 區(qū)別與擴增
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 兩個基因融合構(gòu)建真核表達(dá)載體需要去掉信號肽嗎?
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 英文精細(xì)潤色 生物學(xué) （已附中文）
已經(jīng)有1人回復(fù)
- 請高手潤色英文翻譯 生物學(xué)
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 【求助/交流】酵母表達(dá)和原核表達(dá)，在技術(shù)上有什么不同？
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助】微生物與生化藥學(xué)
已經(jīng)有49人回復(fù)
- 【求助/交流】原核表達(dá)載體pGEX-4T-1對應(yīng)的表達(dá)菌株
已經(jīng)有6人回復(fù)
- [求助]原核表達(dá)如何減少包涵體
已經(jīng)有23人回復(fù)
2樓2012-07-31 19:59:47
3樓2012-07-31 20:44:45
tupac225
金蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 5
- 應(yīng)助: 103 (高中生)
- 金幣: 1967.9
- 散金: 20
- 紅花: 4
- 帖子: 460
- 在線: 175.3小時
- 蟲號: 1533370
- 注冊: 2011-12-11
- 性別: GG
- 專業(yè): 免疫生物學(xué)
4樓2012-07-31 21:00:09
5樓2012-07-31 21:31:57
tupac225
金蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 5
- 應(yīng)助: 103 (高中生)
- 金幣: 1967.9
- 散金: 20
- 紅花: 4
- 帖子: 460
- 在線: 175.3小時
- 蟲號: 1533370
- 注冊: 2011-12-11
- 性別: GG
- 專業(yè): 免疫生物學(xué)
6樓2012-07-31 22:34:34
酶切專家
金蟲 (小有名氣)
- MolEPI: 2
- 應(yīng)助: 96 (初中生)
- 金幣: 1610.8
- 紅花: 4
- 帖子: 149
- 在線: 41.3小時
- 蟲號: 1648414
- 注冊: 2012-02-27
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 還真是酶切專家哦，鼓勵熱心的蟲蟲 2012-08-01 13:44:18
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 還真是酶切專家哦，鼓勵熱心的蟲蟲 2012-08-01 13:44:18
|
克隆不成功最常見的原因是載體或PCR產(chǎn)物酶切不完全。 載體酶切時，最難得部分是如何判斷載體是否完全酶切的方法，因為只有載體的完全雙酶切，才能保證較高的克隆效率，減少假陽性。 一般來說，可以通過電泳分析來初步判斷是否完全酶切： 1）如果你的載體上兩個酶切位點間有一個較大的片段（大于300bp),那么一般通過電泳帶型很容易判斷出雙酶切的效率，因為單切和雙切后的載體大小是不一樣的，而且還有酶切后產(chǎn)生的小片段提供參考。 2）如果你的載體上兩個酶切位點很靠近，如大部分載體的多克隆位點序列。那么判斷載體是否完全雙酶切就比較麻煩。一般比較科學(xué)的方法是設(shè)置兩種單酶切對照。即比照雙酶切體系，分別進(jìn)行實驗所用的兩種酶的單酶切，然后與雙酶切樣品同時進(jìn)行電泳分析，注意，電泳時還需要設(shè)置未酶切的質(zhì)粒對照。通過電泳的帶型來判斷在設(shè)定的酶切條件下（包括質(zhì)量用量，buffer,酶的用量等），酶切是否完全。 3）而PCR產(chǎn)物的酶切效率通常很難判斷，常用的電泳檢測方法也不適用。但PCR產(chǎn)物的酶切還是有一些基本的原則，如： A: 由于PCR產(chǎn)物的分子通產(chǎn)較載體分子小，因而在進(jìn)行PCR產(chǎn)物酶切是，建議用較少的PCR產(chǎn)物（300-500ng)進(jìn)行酶切， B:而且通常PCR產(chǎn)物酶切時所用的酶量較載體酶切所需的酶量還要多（具體原因，可以參考各種限制性內(nèi)切酶的單位定義）。 事實上，由于限制性內(nèi)切酶單位定義的特殊性，不同的酶在實際使用時，所需的用量差別較大（如XbaI的用量就應(yīng)該比KpnI多10倍左右）。建議你使用一些能夠精確計算酶切時限制性內(nèi)切酶用量的軟件計算，確保載體和PCR酶切的完全和徹底。我在小木蟲上推薦過一個軟件（double digestion designer),你可以試一試 |
7樓2012-08-01 00:01:57
8樓2012-08-01 18:58:33
9樓2012-08-01 19:02:01
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵熱心積極交流 2012-08-02 15:39:52
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵熱心積極交流 2012-08-02 15:39:52
|
個人有些想法： 1.先確保載體被切開，分別用你的兩種酶單酶切，雙酶切，然后跑膠，沒有問題再往下做。 2.再確認(rèn)下酶的說明書，PCR產(chǎn)物有些要求，是要切久一點的，不過，你切4h,應(yīng)該夠了。回收后的效率如何，PCR產(chǎn)物有多大？膠回收試劑盒的分辨率可以達(dá)到嗎？ 3.確保連接酶沒有問題，我就試過一次連接酶壞了，做幾次都沒有出來。連接體系中，載體與目的片段如何？ 4.確認(rèn)感受態(tài)木有問題. 希望對你有幫助！ |
10樓2012-08-01 19:59:15
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 wangmin2010 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 求調(diào)劑 +6 | 家佳佳佳佳佳 2026-03-29 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿南航 335分 | 0856 | GPA 4.07 | 有科研經(jīng)歷 +8 | cccchenso 2026-03-29 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +4 | QiMing7 2026-03-25 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 300求調(diào)劑，材料科學(xué)英一數(shù)二 +10 | leaflight 2026-03-24 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 337求調(diào)劑 +4 | 《樹》 2026-03-29 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑（080500） +7 | A child 2026-03-27 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 296求調(diào)劑 +6 | 彼岸t 2026-03-29 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 343求調(diào)劑085601 +3 | 要努力學(xué)習(xí)x 2026-03-29 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿南昌大學(xué)324求調(diào)劑 +5 | hanamiko 2026-03-29 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境工程 085701，267求調(diào)劑 +6 | minht 2026-03-29 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 348求調(diào)劑 +5 | 小懶蟲不懶了 2026-03-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 本科新能源科學(xué)與工程，一志愿華理能動285求調(diào)劑 +3 | AZMK 2026-03-27 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 320分，材料與化工專業(yè)，求調(diào)劑 +9 | 一定上岸aaa 2026-03-27 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 346求調(diào)劑 一志愿070303有機化學(xué) +3 | 蘿卜燉青菜 2026-03-28 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 339求調(diào)劑，想調(diào)回江蘇 +6 | 烤麥芽 2026-03-27 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 330一志愿中國海洋大學(xué) 化學(xué)工程 085602 有讀博意愿 求調(diào)劑 +3 | wywy.. 2026-03-27 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 287求調(diào)劑 +10 | land xuxu 2026-03-26 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 274求調(diào)劑 +17 | 顧九笙要謙虛 2026-03-24 | 23/1150 |
|
|
|
[考研] 343求調(diào)劑 +4 | 贈我一本書 2026-03-23 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | 李李不服輸 2026-03-25 | 3/150 |
|