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[求助]
原核載體構(gòu)建
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求助： 我現(xiàn)在在構(gòu)建一個原核載體，是氯霉素抗性的，我用的是KpnI,XbaI這兩個酶，我一直用的傳統(tǒng)的方法，可就是連不上，PCR回收在酶切，質(zhì)粒酶切，單酶切，都試過了，就是連不上，請問高手們，有沒有遇到過這樣的問題啊1 |
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2樓2012-07-31 19:59:47
3樓2012-07-31 20:44:45
tupac225
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4樓2012-07-31 21:00:09
5樓2012-07-31 21:31:57
tupac225
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6樓2012-07-31 22:34:34
酶切專家
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 還真是酶切專家哦，鼓勵熱心的蟲蟲 2012-08-01 13:44:18
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小丹木木: 金幣+3, 還真是酶切專家哦，鼓勵熱心的蟲蟲 2012-08-01 13:44:18
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克隆不成功最常見的原因是載體或PCR產(chǎn)物酶切不完全。 載體酶切時，最難得部分是如何判斷載體是否完全酶切的方法，因為只有載體的完全雙酶切，才能保證較高的克隆效率，減少假陽性。 一般來說，可以通過電泳分析來初步判斷是否完全酶切： 1）如果你的載體上兩個酶切位點(diǎn)間有一個較大的片段（大于300bp),那么一般通過電泳帶型很容易判斷出雙酶切的效率，因為單切和雙切后的載體大小是不一樣的，而且還有酶切后產(chǎn)生的小片段提供參考。 2）如果你的載體上兩個酶切位點(diǎn)很靠近，如大部分載體的多克隆位點(diǎn)序列。那么判斷載體是否完全雙酶切就比較麻煩。一般比較科學(xué)的方法是設(shè)置兩種單酶切對照。即比照雙酶切體系，分別進(jìn)行實驗所用的兩種酶的單酶切，然后與雙酶切樣品同時進(jìn)行電泳分析，注意，電泳時還需要設(shè)置未酶切的質(zhì)粒對照。通過電泳的帶型來判斷在設(shè)定的酶切條件下（包括質(zhì)量用量，buffer,酶的用量等），酶切是否完全。 3）而PCR產(chǎn)物的酶切效率通常很難判斷，常用的電泳檢測方法也不適用。但PCR產(chǎn)物的酶切還是有一些基本的原則，如： A: 由于PCR產(chǎn)物的分子通產(chǎn)較載體分子小，因而在進(jìn)行PCR產(chǎn)物酶切是，建議用較少的PCR產(chǎn)物（300-500ng)進(jìn)行酶切， B:而且通常PCR產(chǎn)物酶切時所用的酶量較載體酶切所需的酶量還要多（具體原因，可以參考各種限制性內(nèi)切酶的單位定義）。 事實上，由于限制性內(nèi)切酶單位定義的特殊性，不同的酶在實際使用時，所需的用量差別較大（如XbaI的用量就應(yīng)該比KpnI多10倍左右）。建議你使用一些能夠精確計算酶切時限制性內(nèi)切酶用量的軟件計算，確保載體和PCR酶切的完全和徹底。我在小木蟲上推薦過一個軟件（double digestion designer),你可以試一試 |
7樓2012-08-01 00:01:57
8樓2012-08-01 18:58:33
9樓2012-08-01 19:02:01
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵熱心積極交流 2012-08-02 15:39:52
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵熱心積極交流 2012-08-02 15:39:52
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個人有些想法： 1.先確保載體被切開，分別用你的兩種酶單酶切，雙酶切，然后跑膠，沒有問題再往下做。 2.再確認(rèn)下酶的說明書，PCR產(chǎn)物有些要求，是要切久一點(diǎn)的，不過，你切4h,應(yīng)該夠了�；厥蘸蟮男嗜绾危琍CR產(chǎn)物有多大？膠回收試劑盒的分辨率可以達(dá)到嗎？ 3.確保連接酶沒有問題，我就試過一次連接酶壞了，做幾次都沒有出來。連接體系中，載體與目的片段如何？ 4.確認(rèn)感受態(tài)木有問題. 希望對你有幫助！ |
10樓2012-08-01 19:59:15
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