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[交流]
新手用試劑盒提取植物RNA時的一些小問題
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這兩天剛開始接觸植物RNA提取，用的試劑盒，有些小問題不是很清楚，看看大家都是怎么處理的。 1.液氮研磨樣品到什么程度？ 我磨到細粉發(fā)白，中途加了5-6次液氮，每次5-6ml，很快就揮發(fā)了，基本上一直都在磨。 2.如何把樣品移到離心管中？ 離心管用液氮遇冷過，小勺也遇冷過，但是舀到離心管時，發(fā)現(xiàn)小勺進不去，不方便把細粉送進離心管，很多粘在了管口或者離心管接近管口的壁上。 3.如何界定移入的量不超過100mg？ 100mg的細粉，大概有多少？我用2ml 離心管，高度大概5mm，不知道量合適不？ 4.加入裂解液后渦旋，然后再加入0.5倍體積乙醇，在渦旋，有技術(shù)竅門嗎？ 都渦旋，還是手拿著來回搖搖就可以了。 5.勻漿移入吸附柱后會否堵住柱子？ 這個問題與界定樣品的量有關(guān)系，離心之后把吸附柱上都是材料殘渣，會不會有影響？ |
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2樓2012-08-01 22:55:46
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7樓2012-08-02 08:06:39
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beescity(金幣+1): 謝謝參與
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵應(yīng)助 2012-08-02 15:32:22
beescity(金幣+1): 謝謝參與
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵應(yīng)助 2012-08-02 15:32:22
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RNA提取原理： 通過變性劑破碎細胞或者組織，然后經(jīng)過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經(jīng)過沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。 RNA提取的一般步驟 所有RNA的提取過程中都有五個關(guān)鍵點，即：樣品細胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復(fù)合體變性；對內(nèi)源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA 和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中最關(guān)鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性。RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑:提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來；直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進入有機相而RNA留在水相。 第一種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。 實驗步驟： 破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA。 1、 破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。 2、 分離RNA一般用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開。 3、 沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或異丙醇。 4、 洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。 5、 融解RNA一般使用TE。 6、保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的 RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于- 70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g離心5分鐘。 氯化鋰法提取總RNA： 本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA，具有快速簡潔的長處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA丟失的缺陷。 試驗試劑： 1、 氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，過濾滅菌】 2、 懸浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】 試驗步驟： 1、 對于大量組織或細胞，則每克組織或細胞加入5－10ml氯化鋰－尿素溶液，勻槳器高速勻槳2分鐘；對于少量細胞（107個細胞/ml），則每克組織或細胞加入0.5ml氯化鋰－尿素溶液手工勻槳，并轉(zhuǎn)移至Eppendof管中。 2、 勻槳液在0－4℃放置4小時后，12000g離心30分鐘。 3、 取沉淀，加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液，重復(fù)步驟2。 4、 沉淀用原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液復(fù)溶后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置15－30分鐘并不時搖動混勻，4000g離心5分鐘。 5、 取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，－20℃放置1小時，5000g離心。 6、 70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。 7、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分裝，于－70℃保存。 蛋白酶－熱酚法－本方法適合于病毒RNA的提取 試驗試劑： 1、 蛋白酶K（終濃度50ug/ml） 2、 2×緩沖液：1%SDS 20mMTris-HCL (pH 7.6)? 0.2MnaCL 試驗步驟： 1、 提純病毒液中加入等體積緩沖液、蛋白酶K,37℃40-50分鐘。 2、 加入等體積65℃預(yù)熱的酚溶液，輕徭,在65℃保溫5分鐘后再輕徭。 3、 離心，取上清，氯仿抽提一次。 4、 取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，－20℃放置1小時，5000g離心(10000g,10min)。 5、 70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。 6、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分裝，于－70℃保存。 |
9樓2012-08-02 08:43:27
userhung
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16樓2012-08-02 09:58:38
userhung
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17樓2012-08-02 09:59:14
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neu2343樓
2012-08-01 23:08
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2012-08-02 02:55
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小花8218樓
2012-08-02 08:32
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鄭克寧10樓
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wangyanbo14樓
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