 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2887 | 回復(fù): 21 | |||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
[交流]
新手用試劑盒提取植物RNA時的一些小問題
|
|||
|
這兩天剛開始接觸植物RNA提取，用的試劑盒，有些小問題不是很清楚，看看大家都是怎么處理的。 1.液氮研磨樣品到什么程度？ 我磨到細(xì)粉發(fā)白，中途加了5-6次液氮，每次5-6ml，很快就揮發(fā)了，基本上一直都在磨。 2.如何把樣品移到離心管中？ 離心管用液氮遇冷過，小勺也遇冷過，但是舀到離心管時，發(fā)現(xiàn)小勺進不去，不方便把細(xì)粉送進離心管，很多粘在了管口或者離心管接近管口的壁上。 3.如何界定移入的量不超過100mg？ 100mg的細(xì)粉，大概有多少？我用2ml 離心管，高度大概5mm，不知道量合適不？ 4.加入裂解液后渦旋，然后再加入0.5倍體積乙醇，在渦旋，有技術(shù)竅門嗎？ 都渦旋，還是手拿著來回?fù)u搖就可以了。 5.勻漿移入吸附柱后會否堵住柱子？ 這個問題與界定樣品的量有關(guān)系，離心之后把吸附柱上都是材料殘渣，會不會有影響？ |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有63人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 提取RNA的試劑盒哪家的好？
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 植物RNA的提取
已經(jīng)有22人回復(fù)
- SDS-LiCl提取植物RNA
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 提取RNA與做RT-PCR的問題
已經(jīng)有26人回復(fù)
- 植物RNA提取后電泳檢測
已經(jīng)有16人回復(fù)
- RNA 提取的一些問題，請大家?guī)兔卮?/a>
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 新手提RNA，請教幾個問題
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 關(guān)于RNA提取的問題
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 【求助/交流】求助高手-棉花中RNA提取質(zhì)量驗證及反轉(zhuǎn)后cDNA質(zhì)量驗證問題
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 【求助/交流】試劑盒提不出RNA，求救啊
已經(jīng)有39人回復(fù)
- 【求助/交流】植物組織RNA提取求高人指點
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】想問問天根植物總RNA提取試劑盒的使用
已經(jīng)有9人回復(fù)
» 搶金幣啦！回帖就可以得到:
-
山東建筑大學(xué)材料類研究生招生調(diào)劑
+3/191
-
【招聘】溫州醫(yī)科大學(xué)/附屬醫(yī)院/甌江實驗室李校堃院士團隊誠聘博士后和科研人員
+1/190
-
多通道數(shù)據(jù)采集/線性功率放大器租賃｜自動化控制實驗
+1/94
-
宜春學(xué)院 藥學(xué)研究生調(diào)劑52人
+1/53
-
青島大學(xué)固態(tài)電池研究團隊招收材料、化學(xué)、物理等方向博士研究生
+2/46
-
五邑大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院先進有機高分子材料團隊
+1/44
-
廣東省五邑大學(xué)光電催化團隊接受研究生調(diào)劑
+1/38
-
【211博士招生】環(huán)境化學(xué)、地學(xué)、毒理方向，擅長污染物遷移轉(zhuǎn)化降解、計算模擬者優(yōu)先
+1/33
-
西南科技大學(xué)李永升老師接收材料和化工類研究生調(diào)劑
+1/26
-
API項目尋求落地合作
+1/23
-
長安大學(xué)智能爆破課題組招收2026級博士和碩士研究生
+1/21
-
招收2026專業(yè)代碼08開頭碩士研究生
+1/12
-
三峽大學(xué)材料與化工學(xué)院調(diào)劑
+1/10
-
中國地震局地質(zhì)研究所+地球物理專業(yè)+接收調(diào)劑
+1/7
-
中國科學(xué)院大學(xué)納米科學(xué)與技術(shù)學(xué)院-羅聃課題組誠招碩士研究生
+1/5
-
尋找26博士生導(dǎo)師
+1/4
-
招收2026級研究生
+1/4
-
北京高校副校長團隊招收機械類，環(huán)境類學(xué)碩和專碩
+1/4
-
哈工大韓飛課題組招收3D微納加工、光學(xué)工程、納米化學(xué)等方向博士生及博后（長期有效）
+1/3
-
武漢紡織大學(xué)2026年招收碩士研究生【高性能、功能紡織復(fù)合材料方向】
+1/2
4樓2012-08-01 23:12:30
2樓2012-08-01 22:55:46
5樓2012-08-02 00:24:27
★ ★ ★
beescity(金幣+1): 謝謝參與
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵應(yīng)助 2012-08-02 15:32:22
beescity(金幣+1): 謝謝參與
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵應(yīng)助 2012-08-02 15:32:22
|
RNA提取原理： 通過變性劑破碎細(xì)胞或者組織，然后經(jīng)過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經(jīng)過沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。 RNA提取的一般步驟 所有RNA的提取過程中都有五個關(guān)鍵點，即：樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復(fù)合體變性；對內(nèi)源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA 和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中最關(guān)鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性。RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑:提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來；直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進入有機相而RNA留在水相。 第一種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。 實驗步驟： 破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA。 1、 破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。 2、 分離RNA一般用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開。 3、 沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或異丙醇。 4、 洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。 5、 融解RNA一般使用TE。 6、保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的 RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于- 70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g離心5分鐘。 氯化鋰法提取總RNA： 本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA，具有快速簡潔的長處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA丟失的缺陷。 試驗試劑： 1、 氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，過濾滅菌】 2、 懸浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】 試驗步驟： 1、 對于大量組織或細(xì)胞，則每克組織或細(xì)胞加入5－10ml氯化鋰－尿素溶液，勻槳器高速勻槳2分鐘；對于少量細(xì)胞（107個細(xì)胞/ml），則每克組織或細(xì)胞加入0.5ml氯化鋰－尿素溶液手工勻槳，并轉(zhuǎn)移至Eppendof管中。 2、 勻槳液在0－4℃放置4小時后，12000g離心30分鐘。 3、 取沉淀，加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液，重復(fù)步驟2。 4、 沉淀用原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液復(fù)溶后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置15－30分鐘并不時搖動混勻，4000g離心5分鐘。 5、 取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，－20℃放置1小時，5000g離心。 6、 70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。 7、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分裝，于－70℃保存。 蛋白酶－熱酚法－本方法適合于病毒RNA的提取 試驗試劑： 1、 蛋白酶K（終濃度50ug/ml） 2、 2×緩沖液：1%SDS 20mMTris-HCL (pH 7.6)? 0.2MnaCL 試驗步驟： 1、 提純病毒液中加入等體積緩沖液、蛋白酶K,37℃40-50分鐘。 2、 加入等體積65℃預(yù)熱的酚溶液，輕徭,在65℃保溫5分鐘后再輕徭。 3、 離心，取上清，氯仿抽提一次。 4、 取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，－20℃放置1小時，5000g離心(10000g,10min)。 5、 70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。 6、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分裝，于－70℃保存。 |
9樓2012-08-02 08:43:27
簡單回復(fù)
jh838111樓
2012-08-02 09:00
回復(fù)
beescity(金幣+1): 謝謝參與
假大空13樓
2012-08-02 09:17
回復(fù)
beescity(金幣+1): 謝謝參與
祝福。幫
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 070305高分子化學(xué)與物理 304分求調(diào)劑 +6 | c297914 2026-03-28 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 求調(diào)劑一志愿海大，0703化學(xué)學(xué)碩304分，有大創(chuàng)項目，四級已過 +7 | 幸運哩哩 2026-03-22 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 食品工程專碩一志愿中海洋309求調(diào)劑 +4 | 小張zxy張 2026-03-26 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 化學(xué)0703 調(diào)劑 306分 一志愿211 +4 | 26要上岸 2026-03-28 | 4/200 |
|
|
[考研] 0703本科鄭州大學(xué)求調(diào)劑 +3 | nhj_ 2026-03-25 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +6 | 蘆lty 2026-03-25 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿哈爾濱工業(yè)大學(xué)材料與化工方向336分 +8 | 辰沐5211314 2026-03-26 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 315分求調(diào)劑 +7 | 26考研上岸版26 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 085701環(huán)境工程求調(diào)劑 +9 | 多久上課 2026-03-27 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 一志愿華東理工大學(xué)081700，初試分?jǐn)?shù)271 +6 | kotoko_ik 2026-03-23 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 312求調(diào)劑 +9 | 上岸吧ZJY 2026-03-22 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 一志愿鄭大085600，310分求調(diào)劑 +5 | 李瀟可 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿北化求調(diào)劑 +3 | Jsman 2026-03-22 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料與化工304求B區(qū)調(diào)劑 +3 | 邱gl 2026-03-26 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 生物技術(shù)與工程 +3 | 1294608413 2026-03-25 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 上海電力大學(xué)材料防護與新材料重點實驗室招收調(diào)劑研究生（材料、化學(xué)、電化學(xué)，環(huán)境） +4 | 我愛學(xué)電池 2026-03-23 | 4/200 |
|
|
|
[有機交流]
 有機合成求助
20+3
|
FENGSHUJEI 2026-03-23 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 361求調(diào)劑 +3 | Glack 2026-03-22 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 求老師收我 +3 | zzh16938784 2026-03-23 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 石河子大學(xué)（211、雙一流）碩博研究生長期招生公告 +3 | 李子目 2026-03-22 | 3/150 |
|