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yexiaoqi7

銀蟲(chóng) (小有名氣)

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[求助] 葉片中谷氨酸合酶和谷氨酰胺合成酶

請(qǐng)問(wèn)哪位高人有測(cè)定植株中谷氨酸合酶及谷氨酰胺合成酶的具體方法��？

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用心去看世界

1樓 2012-08-07 21:44:04

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zhaofeng8866

銀蟲(chóng) (初入文壇)

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【答案】應(yīng)助回帖

4.3 谷酰胺合成酶（GS）的測(cè)定：
方法1：
O.25mol／L 咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.0)：
O.30mol／L 谷氨酸鈉溶液(pH7.O)：
30mmol／L ATP—Na溶液(pH7.O)：
O.5mol／L MgS04溶液：
羥胺試劑：
FeCl3溶液：
測(cè)定酶活性反應(yīng)液組成如下：0.6ml咪唑-鹽酸緩沖液(O．25mol／L，pH7.0),0.4ml谷氨酸鈉溶液(O.30mol／L，pH7.O)，0.4ml ATP—Na溶液(30mmol／L，pH7.O)，0.2ml MgS04溶液(O.5mol／L)，酶粗液1.2ml。反應(yīng)液在25℃水浴中保溫5 min后，加入0.2 ml羥胺試劑開(kāi)始反應(yīng)，15 min后立即加入0.8 ml酸性FeCl3試劑終止反應(yīng)�；旌弦涸�4000 r／min離心15 min，測(cè)定上清液在540nm處的光密度。一個(gè)GS活性單位定義為該反應(yīng)條件下，在15min反應(yīng)時(shí)間內(nèi)催化形成1µmol r-谷氨酰異羥肟酸需要的酶量，總活性為：每克鮮樣酶粗液在15min的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)催化形成r-谷氨酰異羥肟酸的µmol數(shù)。（參考王小純，熊淑萍，馬新明，張娟娟，王志強(qiáng)的《不同形態(tài)氮素對(duì)專(zhuān)用型小麥花后氮代謝關(guān)鍵酶活性及籽粒蛋白質(zhì)含量的影響》）
方法2：
酶活性反應(yīng)液組成為：0.6 ml咪唑-鹽酸緩沖液，0.4 ml谷氨酸鈉溶液，0.4 ml ATP-Na溶液(30 mmol/L，pH 7．0)，MgSO4溶液(0.5 mol/L )，酶提取液1.2 ml。反應(yīng)液0.2 ml在25℃水浴中保溫 5 min，加入0.2 ml羥胺試劑開(kāi)始反應(yīng)。在25℃水浴中反應(yīng)15min，加入0.8 ml反應(yīng)終止液�；旌弦涸�4000×g離心15 min，在540 nm處測(cè)定上清液的光密度。一個(gè)GS活性單位定義為在該反應(yīng)條件下，15 min反應(yīng)時(shí)間內(nèi)每克鮮重光密度的數(shù)值。（參考馬新明，李琳，趙鵬，熊淑萍，郭飛的《土壤水分對(duì)強(qiáng)筋小麥‘豫麥34’氮素同化酶活性和籽粒品質(zhì)的影響》）
方法3：（參考趙志杰，史國(guó)安，董新純編的《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》）

方法4：依次取lml 咪唑-鹽酸緩沖液、0．5mol／L MgCl•6H20、50mmol／L EDTA—Na 、lmol／L Glu—Na 、0．498mmol／L鹽酸羥胺各0．2mL放入試管中，在迅速加入lmL粗酶液混勻，于30cC水浴上反應(yīng)15min，然后立即取出，加入lmL終止顯色液(0.37mol／L FeC1 、0.67mol／L三氯乙酸、0.2moL／L HC1)終止反應(yīng)，在5000r／min下離心10min，取上清液測(cè)540nm處消光值，對(duì)照在加完所有反應(yīng)液后，先加入lmL終止顯色液，再加入lmL粗酶液，對(duì)照管的其余步驟與測(cè)試管相同。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出r-谷氨酰胺基羥肟酸的生成量，計(jì)算酶的活性。（參考趙越，魏自民，馬鳳鳴的《不同水平銨態(tài)氮對(duì)甜菜硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活力的影響》）

4.4 谷氨酸合酶（GOGAT）的測(cè)定：
反應(yīng)混合液包括0.4ml 20mmol／L的 L-谷氨酰胺，0.5ml 20mmol／L的a一酮戊二酸，0.1ml 10mmol／L的KCl，0.2ml 3mmol／L NADH和0.3ml酶液，總體積3.0ml，不足部分用25mmol／L的Tris-HCI緩沖液(pH7.6)補(bǔ)足(1．5m1)。反應(yīng)啟動(dòng)后，用752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于340nm處每30s測(cè)定1個(gè)消光值，連續(xù)測(cè)定11次，取光密度穩(wěn)定減小的一段來(lái)衡量酶活性。一個(gè)GOGAT活性單位定義為在該反應(yīng)條件下，每分鐘反應(yīng)混合液減少1µmolNADH為一個(gè)酶活性單位。（參考王小純，熊淑萍，馬新明，張娟娟，王志強(qiáng)的《不同形態(tài)氮素對(duì)專(zhuān)用型小麥花后氮代謝關(guān)鍵酶活性及籽粒蛋白質(zhì)含量的影響》）

4.5 谷氨酸脫氫酶(GDH) 的測(cè)定：
提取液：0.2 mmol／L pH 8.2 Tris-HCl緩沖液。
反應(yīng)液A：1.6µmol／L NAD + 360µmol／L Tris-HC1緩沖液。
反應(yīng)液B：60µmol／L L一谷氨酸 + 1.6µmol／I NAD + 360µmol／L Tris-HC1緩沖液。
1 mL酶提取液+2 mL反應(yīng)液B，以加反應(yīng)液A為對(duì)照于340 nm處比色，每隔30s記錄一次0D值，直至讀數(shù)穩(wěn)定。（參考張智猛，張威，胡文廣，矯巖林，王磊，李偉芳的《高產(chǎn)花生氮素代謝相關(guān)酶活性變化的研究》）

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回復(fù)此樓

在等待中蹉跎歲月不如在失敗中尋找出路

2樓2012-08-22 23:35:01

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