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yexiaoqi7

銀蟲 (小有名氣)

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[求助] 葉片中谷氨酸合酶和谷氨酰胺合成酶

請問哪位高人有測定植株中谷氨酸合酶及谷氨酰胺合成酶的具體方法��？

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1樓 2012-08-07 21:44:04

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zhaofeng8866

銀蟲 (初入文壇)

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【答案】應(yīng)助回帖

4.3 谷酰胺合成酶（GS）的測定：
方法1：
O.25mol／L 咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.0)：
O.30mol／L 谷氨酸鈉溶液(pH7.O)：
30mmol／L ATP—Na溶液(pH7.O)：
O.5mol／L MgS04溶液：
羥胺試劑：
FeCl3溶液：
測定酶活性反應(yīng)液組成如下：0.6ml咪唑-鹽酸緩沖液(O．25mol／L，pH7.0),0.4ml谷氨酸鈉溶液(O.30mol／L，pH7.O)，0.4ml ATP—Na溶液(30mmol／L，pH7.O)，0.2ml MgS04溶液(O.5mol／L)，酶粗液1.2ml。反應(yīng)液在25℃水浴中保溫5 min后，加入0.2 ml羥胺試劑開始反應(yīng)，15 min后立即加入0.8 ml酸性FeCl3試劑終止反應(yīng)�；旌弦涸�4000 r／min離心15 min，測定上清液在540nm處的光密度。一個GS活性單位定義為該反應(yīng)條件下，在15min反應(yīng)時間內(nèi)催化形成1µmol r-谷氨酰異羥肟酸需要的酶量，總活性為：每克鮮樣酶粗液在15min的反應(yīng)時間內(nèi)催化形成r-谷氨酰異羥肟酸的µmol數(shù)。（參考王小純，熊淑萍，馬新明，張娟娟，王志強(qiáng)的《不同形態(tài)氮素對專用型小麥花后氮代謝關(guān)鍵酶活性及籽粒蛋白質(zhì)含量的影響》）
方法2：
酶活性反應(yīng)液組成為：0.6 ml咪唑-鹽酸緩沖液，0.4 ml谷氨酸鈉溶液，0.4 ml ATP-Na溶液(30 mmol/L，pH 7．0)，MgSO4溶液(0.5 mol/L )，酶提取液1.2 ml。反應(yīng)液0.2 ml在25℃水浴中保溫 5 min，加入0.2 ml羥胺試劑開始反應(yīng)。在25℃水浴中反應(yīng)15min，加入0.8 ml反應(yīng)終止液�；旌弦涸�4000×g離心15 min，在540 nm處測定上清液的光密度。一個GS活性單位定義為在該反應(yīng)條件下，15 min反應(yīng)時間內(nèi)每克鮮重光密度的數(shù)值。（參考馬新明，李琳，趙鵬，熊淑萍，郭飛的《土壤水分對強(qiáng)筋小麥‘豫麥34’氮素同化酶活性和籽粒品質(zhì)的影響》）
方法3：（參考趙志杰，史國安，董新純編的《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》）

方法4：依次取lml 咪唑-鹽酸緩沖液、0．5mol／L MgCl•6H20、50mmol／L EDTA—Na 、lmol／L Glu—Na 、0．498mmol／L鹽酸羥胺各0．2mL放入試管中，在迅速加入lmL粗酶液混勻，于30cC水浴上反應(yīng)15min，然后立即取出，加入lmL終止顯色液(0.37mol／L FeC1 、0.67mol／L三氯乙酸、0.2moL／L HC1)終止反應(yīng)，在5000r／min下離心10min，取上清液測540nm處消光值，對照在加完所有反應(yīng)液后，先加入lmL終止顯色液，再加入lmL粗酶液，對照管的其余步驟與測試管相同。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出r-谷氨酰胺基羥肟酸的生成量，計算酶的活性。（參考趙越，魏自民，馬鳳鳴的《不同水平銨態(tài)氮對甜菜硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活力的影響》）

4.4 谷氨酸合酶（GOGAT）的測定：
反應(yīng)混合液包括0.4ml 20mmol／L的 L-谷氨酰胺，0.5ml 20mmol／L的a一酮戊二酸，0.1ml 10mmol／L的KCl，0.2ml 3mmol／L NADH和0.3ml酶液，總體積3.0ml，不足部分用25mmol／L的Tris-HCI緩沖液(pH7.6)補(bǔ)足(1．5m1)。反應(yīng)啟動后，用752紫外可見分光光度計于340nm處每30s測定1個消光值，連續(xù)測定11次，取光密度穩(wěn)定減小的一段來衡量酶活性。一個GOGAT活性單位定義為在該反應(yīng)條件下，每分鐘反應(yīng)混合液減少1µmolNADH為一個酶活性單位。（參考王小純，熊淑萍，馬新明，張娟娟，王志強(qiáng)的《不同形態(tài)氮素對專用型小麥花后氮代謝關(guān)鍵酶活性及籽粒蛋白質(zhì)含量的影響》）

4.5 谷氨酸脫氫酶(GDH) 的測定：
提取液：0.2 mmol／L pH 8.2 Tris-HCl緩沖液。
反應(yīng)液A：1.6µmol／L NAD + 360µmol／L Tris-HC1緩沖液。
反應(yīng)液B：60µmol／L L一谷氨酸 + 1.6µmol／I NAD + 360µmol／L Tris-HC1緩沖液。
1 mL酶提取液+2 mL反應(yīng)液B，以加反應(yīng)液A為對照于340 nm處比色，每隔30s記錄一次0D值，直至讀數(shù)穩(wěn)定。（參考張智猛，張威，胡文廣，矯巖林，王磊，李偉芳的《高產(chǎn)花生氮素代謝相關(guān)酶活性變化的研究》）

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回復(fù)此樓

在等待中蹉跎歲月不如在失敗中尋找出路

2樓2012-08-22 23:35:01

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