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roy5513新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助各位大神關(guān)于含組氨酸標(biāo)簽蛋白純化的問(wèn)題
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| 各位大神，我的蛋白加上組氨酸標(biāo)簽后理論大小約8.5KDa，經(jīng)Ni親和層析純化后進(jìn)行透析濃縮，之后跑蛋白電泳發(fā)現(xiàn)大小小于6KDa，這是怎么回事��？?jī)蓚�(gè)蛋白都是這樣。在進(jìn)行蛋白水平之前工程菌的質(zhì)粒都經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，插入片段的序列都正確。求大神指教啊�。。。。。�！ |
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gelois
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7樓2012-08-22 14:59:31
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2樓2012-08-22 08:51:05
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-08-22 15:19:02
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-08-22 15:19:02
| 首先確定是蛋白沒(méi)有掛上柱子都流穿了，還是蛋白沒(méi)有被洗脫下來(lái)。原因可能有很多，比如組氨酸標(biāo)簽沒(méi)有完全暴露或者丟失，或超聲的功率太大，蛋白炭化，沒(méi)有釋放出來(lái)�？梢栽谧冃詶l件下用4M-6M鹽酸胍進(jìn)行純化；若是洗脫有問(wèn)題可以增加咪唑的梯度洗脫或加非離子去污劑（2%TritonX-100）至緩沖液中防止非特異性疏水作用。。。。。得自己慢慢摸索呀，祝實(shí)驗(yàn)順利！能把圖片發(fā)上來(lái)看看嗎？ |
3樓2012-08-22 09:06:47
gelois
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-08-22 15:19:10
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-08-22 15:19:10
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想問(wèn)下，你是跑的SDS-PAGE么？對(duì)于分子量小于15KD的，一般都介意跑tricine sds page，用小MARKER，雖然過(guò)程比較麻煩，但是看得稍微準(zhǔn)確一點(diǎn)。 其次，跑膠看大小，其實(shí)也只能當(dāng)做是一種大致的辨認(rèn)手段，很多時(shí)候蛋白都會(huì)出現(xiàn)偏大或者偏小的情況，想要比較精確的知道，有條件的話，就最好去打個(gè)MS確認(rèn)一下。 |
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roy55134樓2012-08-22 10:17:34
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