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lilirong2009銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
短片段PCR擴增
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我最近在擴增三個目的條帶，長度分別是65,144和236bp。我用的25微升體系，鎂離子的終濃度是2.5mM，酶是1.25u，引物的Tm均為55℃。PCR條件為： （1）95℃ 3min （2）95℃ 30s （3）60-50 ℃ （gradient 10℃）40s （4）72℃ 45s （5）（2）-（4）39 （6）72℃ 10min （7）4℃ forever 用上面的變化退火條件下65bp和144bp的目的條帶均擴增出來，且每個溫度都可擴增出來條帶，但是量不大，電泳條帶較暗。236bp的條帶在8個變化溫度下均未擴增出來。今天下午針對236bp的目的條帶，我把dNTP、模板和酶都增加0.2微升，PCR條件中退火溫度變?yōu)?0-45℃ （gradient 15℃）45s，延伸時間變?yōu)?0s，結(jié)果如圖中的a-j條帶，但是也出現(xiàn)了非特異性條帶，只有退火溫度為57.5℃的未出現(xiàn)非特異性，但是條帶很淡。我在這個PCR條件下同時還做了64bp和144bp的樣（但體系加樣量不變），結(jié)果如圖中1-6條帶，條帶還是暗淡。針對此實驗，有兩問題忘高人幫忙： （1）對于236bp目的條帶的擴增如何改動以減少非特異性條帶 （2）對于3個目的條帶如何增加產(chǎn)量 |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 鼓勵積極解答問題 2012-08-27 13:33:10
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小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 鼓勵積極解答問題 2012-08-27 13:33:10
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對于特異性，你的pcr結(jié)果已經(jīng)不錯了，個人不建議你為了增加特異性而再增加退火溫度；pcr的循環(huán)數(shù)一般20--35個循環(huán)足矣，到后期你里面的dNTP也都沒有了，都是無效循環(huán)。所以建議你減少循環(huán)數(shù)；同時也建議你減少退火時間到25s或30s。 對于產(chǎn)量，有幾個建議： 增加PCR平行數(shù)，以量增加最后產(chǎn)量； 將你的pcr產(chǎn)物稀釋100--200倍后作為模板再進(jìn)行pcr； 利用touch down PCR，一定程度可以增加。 對于pcr，建議不要加太多酶，不出條帶應(yīng)該繼續(xù)降低退火溫度。一般pcr的退火溫度比算出來的Tm值少5--10度。 以上僅為個人建議。 |
5樓2012-08-27 12:23:04
lidonghong
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2樓2012-08-27 10:32:49
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3樓2012-08-27 10:50:10
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6樓2012-08-27 12:55:06
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