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luba

新蟲(chóng) (小有名氣)

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[交流] 克隆求助，都兩個(gè)多月了

要做一個(gè)克隆，把已經(jīng)構(gòu)建好的一個(gè)載體(pCDNA4)上的一個(gè)基因切下來(lái)，換成另一個(gè)。而這另一個(gè)基因也是從一個(gè)載體(pCDNA3.1)上切下來(lái)的。用到的雙酶切位點(diǎn)是BamHI和SpeI,都是用的TAKARA的，10*Kbuffer,37度。之前因?yàn)閜CDNA系列載體上都有兩個(gè)SpeI位點(diǎn)，切下來(lái)好多條帶，就把pCDNA4做了個(gè)定點(diǎn)突變，然后再切，就只有我要的條帶了。所以感覺(jué)切應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題，因?yàn)榍邢聛?lái)的條帶都能看到。連接也是過(guò)夜的。就是不長(zhǎng)克隆，還做了單單載體的對(duì)照，也沒(méi)長(zhǎng)。一個(gè)菌都沒(méi)有！就有一次，拿錯(cuò)了，還拿了原來(lái)沒(méi)做過(guò)突變的pCDNA4來(lái)切的，結(jié)果還長(zhǎng)了，挑了幾個(gè)克隆，用另一個(gè)酶鑒定了下，貌似是連在另一對(duì)B-S的位置上了（前面說(shuō)過(guò)，有兩個(gè)SpeI位點(diǎn)，BamHI位點(diǎn)在這兩個(gè)中間），不過(guò)為了保險(xiǎn)也拿去測(cè)序了，還不知道結(jié)果。。。。
還做過(guò)分步酶切，轉(zhuǎn)化時(shí)也把量加大了，感受態(tài)用過(guò)DH5A，也用過(guò)JM109,真是什么方法都用過(guò)了，實(shí)在不曉得原因！很煩！什么事情都沒(méi)心情了！請(qǐng)大家?guī)臀蚁胂�，出出主意！再這樣下去我也不好意思再待者了，太打擊人了。。。。

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1樓 2012-08-27 21:37:23

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lidonghong

金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

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小丹木木: 金幣+1, 鼓勵(lì)交流 2012-08-30 14:36:51

首先你要保證載體(pCDNA4)和目的基因酶切成功，然后再按照樓上的比例進(jìn)行連接，連接時(shí)的條件可以修改下，不一定要16度過(guò)夜，18度 22度連接也是可以的，具體條件看看你的連接酶使用說(shuō)明書(shū)！

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4樓2012-08-28 08:36:00

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yandz680717

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
1949stone: 金幣+1, 鼓勵(lì) 2012-08-28 07:20:50

換連接酶，注意載體和外源片段的摩爾比1:5-1:10

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回復(fù)此樓

3樓2012-08-28 06:13:17

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snzydong

鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)

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主要問(wèn)題是你連接不長(zhǎng) 做轉(zhuǎn)化的時(shí)候有對(duì)照么對(duì)照長(zhǎng)了么感受態(tài)是買(mǎi)的么有品質(zhì)保證么

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回復(fù)此樓

5樓2012-08-28 08:50:35

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101202139

銅蟲(chóng) (小有名氣)

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構(gòu)建克隆的兩個(gè)主要點(diǎn)：一個(gè)是你的載體處理的要干凈，另外你的感受態(tài)效率要高。

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6樓2012-08-28 09:39:59

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