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克隆求助，都兩個(gè)多月了
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要做一個(gè)克隆，把已經(jīng)構(gòu)建好的一個(gè)載體(pCDNA4)上的一個(gè)基因切下來(lái)，換成另一個(gè)。而這另一個(gè)基因也是從一個(gè)載體(pCDNA3.1)上切下來(lái)的。用到的雙酶切位點(diǎn)是BamHI和SpeI,都是用的TAKARA的，10*Kbuffer,37度。之前因?yàn)閜CDNA系列載體上都有兩個(gè)SpeI位點(diǎn)，切下來(lái)好多條帶，就把pCDNA4做了個(gè)定點(diǎn)突變，然后再切，就只有我要的條帶了。所以感覺(jué)切應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題，因?yàn)榍邢聛?lái)的條帶都能看到。連接也是過(guò)夜的。就是不長(zhǎng)克隆，還做了單單載體的對(duì)照，也沒(méi)長(zhǎng)。一個(gè)菌都沒(méi)有！就有一次，拿錯(cuò)了，還拿了原來(lái)沒(méi)做過(guò)突變的pCDNA4來(lái)切的，結(jié)果還長(zhǎng)了，挑了幾個(gè)克隆，用另一個(gè)酶鑒定了下，貌似是連在另一對(duì)B-S的位置上了（前面說(shuō)過(guò)，有兩個(gè)SpeI位點(diǎn)，BamHI位點(diǎn)在這兩個(gè)中間），不過(guò)為了保險(xiǎn)也拿去測(cè)序了，還不知道結(jié)果。。。。 還做過(guò)分步酶切，轉(zhuǎn)化時(shí)也把量加大了，感受態(tài)用過(guò)DH5A，也用過(guò)JM109,真是什么方法都用過(guò)了，實(shí)在不曉得原因！很煩！什么事情都沒(méi)心情了！請(qǐng)大家?guī)臀蚁胂耄龀鲋饕�！再這樣下去我也不好意思再待者了，太打擊人了。。。。 |
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10樓2012-08-28 10:57:31
11樓2012-08-28 11:13:29
夢(mèng)婷婷玉麗
木蟲 (職業(yè)作家)
- 應(yīng)助: 22 (小學(xué)生)
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12樓2012-08-28 11:18:39
13樓2012-08-28 13:17:32
★ ★ ★ ★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
luba: 金幣+1 2012-08-28 21:27:58
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-08-30 14:37:19
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luba: 金幣+1 2012-08-28 21:27:58
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-08-30 14:37:19
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我有些建議，不一定能解決你的問(wèn)題，希望能給你一些參考。 試驗(yàn)中可能會(huì)碰到很多奇奇怪怪的問(wèn)題，能找到原因當(dāng)然最好，很多問(wèn)題可能并不是由于我們自身問(wèn)題造成的，一些我們不可控力的存在，讓問(wèn)題的解決變得迷離，排除起來(lái)很困難。如果一時(shí)半刻找不到原因，何不另辟蹊徑？ 我說(shuō)一下我的思路，如果是我要做這個(gè)實(shí)驗(yàn)碰到這些問(wèn)題后我會(huì)這樣做 1、重新尋找合適的PCDNA4和目標(biāo)基因的酶切位點(diǎn) 2、以酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物（兩端保護(hù)堿基不可忘）對(duì)PCDNA4進(jìn)行擴(kuò)增 3、以目的基因（PCDNA3.1上的基因）兩端為引物，在其末端添加正確的酶切位點(diǎn)堿基及保護(hù)堿基，對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增 4、雙酶切，回收 5、連接 6、轉(zhuǎn)化 我曾經(jīng)成功的用這種方法解決過(guò)類似問(wèn)題，希望能給樓主一些幫助 |
15樓2012-08-28 16:16:30
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zhaowei3563
木蟲 (職業(yè)作家)
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27樓2012-08-29 16:19:06
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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luba: 金幣+2 2012-08-30 22:23:35
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-08-30 14:37:41
luba: 金幣+2 2012-08-30 22:23:35
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這個(gè)無(wú)所謂啊 你完全可以把這兩個(gè)酶切位點(diǎn)通過(guò)PCR的方式換成其他的，或者都不換還是用這兩個(gè)，一點(diǎn)都不會(huì)影響其他。 使用PCR擴(kuò)增方法的好處是能得到大量而且很純的線狀載體及目的片段，對(duì)于后面的實(shí)驗(yàn)從質(zhì)及量上給予保證。當(dāng)然PCR反應(yīng)必須要使用高保真酶。 [ Last edited by 三十不惑 on 2012-8-29 at 19:57 ] |
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