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luba

新蟲 (小有名氣)

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[交流] 克隆求助，都兩個(gè)多月了

要做一個(gè)克隆，把已經(jīng)構(gòu)建好的一個(gè)載體(pCDNA4)上的一個(gè)基因切下來，換成另一個(gè)。而這另一個(gè)基因也是從一個(gè)載體(pCDNA3.1)上切下來的。用到的雙酶切位點(diǎn)是BamHI和SpeI,都是用的TAKARA的，10*Kbuffer,37度。之前因?yàn)閜CDNA系列載體上都有兩個(gè)SpeI位點(diǎn)，切下來好多條帶，就把pCDNA4做了個(gè)定點(diǎn)突變，然后再切，就只有我要的條帶了。所以感覺切應(yīng)該沒有問題，因?yàn)榍邢聛淼臈l帶都能看到。連接也是過夜的。就是不長(zhǎng)克隆，還做了單單載體的對(duì)照，也沒長(zhǎng)。一個(gè)菌都沒有！就有一次，拿錯(cuò)了，還拿了原來沒做過突變的pCDNA4來切的，結(jié)果還長(zhǎng)了，挑了幾個(gè)克隆，用另一個(gè)酶鑒定了下，貌似是連在另一對(duì)B-S的位置上了（前面說過，有兩個(gè)SpeI位點(diǎn)，BamHI位點(diǎn)在這兩個(gè)中間），不過為了保險(xiǎn)也拿去測(cè)序了，還不知道結(jié)果。。。。
還做過分步酶切，轉(zhuǎn)化時(shí)也把量加大了，感受態(tài)用過DH5A，也用過JM109,真是什么方法都用過了，實(shí)在不曉得原因！很煩！什么事情都沒心情了！請(qǐng)大家?guī)臀蚁胂�，出出主意！再這樣下去我也不好意思再待者了，太打擊人了。。。。

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1樓 2012-08-27 21:37:23

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三十不惑

銅蟲 (小有名氣)

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luba: 金幣+2 2012-08-30 22:23:35

引用回帖:

22樓: Originally posted by luba at 2012-08-28 21:27:55
謝謝，只不過我之所以要用那個(gè)位點(diǎn)是因?yàn)橐弥斑B在那個(gè)基因后的一個(gè)熒光標(biāo)簽，所以只能是那兩個(gè)位點(diǎn)，把那個(gè)基因換成我現(xiàn)在要用的...

這個(gè)無所謂啊你完全可以把這兩個(gè)酶切位點(diǎn)通過PCR的方式換成其他的，或者都不換還是用這兩個(gè)，一點(diǎn)都不會(huì)影響其他。
使用PCR擴(kuò)增方法的好處是能得到大量而且很純的線狀載體及目的片段，對(duì)于后面的實(shí)驗(yàn)從質(zhì)及量上給予保證。當(dāng)然PCR反應(yīng)必須要使用高保真酶。

[ Last edited by 三十不惑 on 2012-8-29 at 19:57 ]

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28樓2012-08-29 19:49:10

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yandz680717

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1949stone: 金幣+1, 鼓勵(lì) 2012-08-28 07:20:50

換連接酶，注意載體和外源片段的摩爾比1:5-1:10

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3樓2012-08-28 06:13:17

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lidonghong

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首先你要保證載體(pCDNA4)和目的基因酶切成功，然后再按照樓上的比例進(jìn)行連接，連接時(shí)的條件可以修改下，不一定要16度過夜，18度 22度連接也是可以的，具體條件看看你的連接酶使用說明書！

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4樓2012-08-28 08:36:00

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snzydong

鐵桿木蟲 (著名寫手)

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主要問題是你連接不長(zhǎng) 做轉(zhuǎn)化的時(shí)候有對(duì)照么對(duì)照長(zhǎng)了么感受態(tài)是買的么有品質(zhì)保證么

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5樓2012-08-28 08:50:35

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