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[交流]
克隆求助，都兩個多月了
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要做一個克隆，把已經(jīng)構(gòu)建好的一個載體(pCDNA4)上的一個基因切下來，換成另一個。而這另一個基因也是從一個載體(pCDNA3.1)上切下來的。用到的雙酶切位點是BamHI和SpeI,都是用的TAKARA的，10*Kbuffer,37度。之前因為pCDNA系列載體上都有兩個SpeI位點，切下來好多條帶，就把pCDNA4做了個定點突變，然后再切，就只有我要的條帶了。所以感覺切應(yīng)該沒有問題，因為切下來的條帶都能看到。連接也是過夜的。就是不長克隆，還做了單單載體的對照，也沒長。一個菌都沒有！就有一次，拿錯了，還拿了原來沒做過突變的pCDNA4來切的，結(jié)果還長了，挑了幾個克隆，用另一個酶鑒定了下，貌似是連在另一對B-S的位置上了（前面說過，有兩個SpeI位點，BamHI位點在這兩個中間），不過為了保險也拿去測序了，還不知道結(jié)果。。。。 還做過分步酶切，轉(zhuǎn)化時也把量加大了，感受態(tài)用過DH5A，也用過JM109,真是什么方法都用過了，實在不曉得原因！很煩！什么事情都沒心情了！請大家?guī)臀蚁胂耄龀鲋饕�！再這樣下去我也不好意思再待者了，太打擊人了。。。。 |
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13樓2012-08-28 13:17:32
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
luba: 金幣+1 2012-08-28 21:27:58
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵交流 2012-08-30 14:37:19
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
luba: 金幣+1 2012-08-28 21:27:58
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵交流 2012-08-30 14:37:19
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我有些建議，不一定能解決你的問題，希望能給你一些參考。 試驗中可能會碰到很多奇奇怪怪的問題，能找到原因當然最好，很多問題可能并不是由于我們自身問題造成的，一些我們不可控力的存在，讓問題的解決變得迷離，排除起來很困難。如果一時半刻找不到原因，何不另辟蹊徑？ 我說一下我的思路，如果是我要做這個實驗碰到這些問題后我會這樣做 1、重新尋找合適的PCDNA4和目標基因的酶切位點 2、以酶切位點設(shè)計引物（兩端保護堿基不可忘）對PCDNA4進行擴增 3、以目的基因（PCDNA3.1上的基因）兩端為引物，在其末端添加正確的酶切位點堿基及保護堿基，對目的基因進行擴增 4、雙酶切，回收 5、連接 6、轉(zhuǎn)化 我曾經(jīng)成功的用這種方法解決過類似問題，希望能給樓主一些幫助 |
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