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新手入門，想問一下關(guān)于未知基因的表達(dá)
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| 如題，如果我知道一株菌有某種功能，但是相關(guān)的基因卻沒有報(bào)道過，如何才能把這個(gè)基因找出來克隆至模式菌株中表達(dá)？ 新手入門，謝謝各位指教！ |
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 基因克隆與表達(dá) |
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3樓2012-08-28 20:31:17
【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zdwxxw: 金幣+10, ★★★很有幫助, 謝謝 2012-08-28 20:25:43
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zdwxxw: 金幣+10, ★★★很有幫助, 謝謝 2012-08-28 20:25:43
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通過文獻(xiàn)知道這種功能的代謝途徑，即確定是表達(dá)了哪個(gè)基因→在NCBI上查找此菌的其他亞類的此基因基因序列，通過對(duì)比序列設(shè)計(jì)引物（有可能是兼并引物）→提取此菌基因組，通過pcr獲得基因→與T載體連接，轉(zhuǎn)化入模式菌種→提出質(zhì)粒，測(cè)序→測(cè)序結(jié)果正確后，轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌種。 這是一般流程，你要具體說明一下你的情況。 |
2樓2012-08-28 15:26:30
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
zdwxxw: 金幣+20, ★★★很有幫助, 多謝了，很有幫助，可能以后還會(huì)有什么問題，到時(shí)再打攪您，請(qǐng)不吝賜教！再次表示感謝！ 2012-08-28 21:31:49
rainwander: MicEPI+1, 鼓勵(lì)交流 2012-08-29 07:45:48
zdwxxw: 金幣+20, ★★★很有幫助, 多謝了，很有幫助，可能以后還會(huì)有什么問題，到時(shí)再打攪您，請(qǐng)不吝賜教！再次表示感謝！ 2012-08-28 21:31:49
rainwander: MicEPI+1, 鼓勵(lì)交流 2012-08-29 07:45:48
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可以的。研究得少的東西容易出成果。我現(xiàn)在能想到的有兩種方法： 當(dāng)然，最先要做的是把這種菌株篩出來，因?yàn)橐话愕木瓴⒉粫?huì)過量產(chǎn)一種酶，或者表達(dá)這種酶的高活性。如果你通過誘變甚至定向進(jìn)化的方法，可能是①解除其調(diào)控，使酶過量表達(dá)；②酶活提高，酶學(xué)性質(zhì)也提高了。如果是①的情況，該酶本身的性質(zhì)可能并沒有改變，只是調(diào)控限制被解除了，但是做克隆表達(dá)也是可以嘗試的；如果是②的情況，說明酶的基因改變導(dǎo)致內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這種酶做克隆表達(dá)是很有價(jià)值的。但我認(rèn)為，無論哪種情況，都可以做克隆表達(dá)。然后怎樣獲得該酶基因，大概我知道的有兩種： （1）我上面所說的，你可以分析一下“少數(shù)幾種菌的產(chǎn)酶基因被報(bào)道過”的這些菌株中，該酶基因的一致程度，如果基因前面幾十個(gè)堿基和最后幾十個(gè)堿基是相似的，則可以根據(jù)這些序列設(shè)計(jì)（兼并）引物，以你篩出的菌的基因組為模版進(jìn)行pcr調(diào)出基因。后面的操作是很模式化的（不同實(shí)驗(yàn)室有區(qū)別），pcr得到目的基因→膠回收→加A→純化→連接T載體→轉(zhuǎn)化JM109→保藏甘油管、提質(zhì)粒、質(zhì)粒測(cè)序→轉(zhuǎn)化表達(dá)載體→發(fā)酵做酶學(xué)性質(zhì)分析。 （2）如果你不知道基因，則需要將蛋白純化出來，測(cè)定蛋白N端、C端蛋白質(zhì)序列，根據(jù)序列設(shè)計(jì)兼并引物，按（1）的步驟調(diào)取基因。 應(yīng)該還有其他方法，你可以看看分子生物學(xué)的教材，看別人用什么方法調(diào)基因。 |
4樓2012-08-28 21:25:19
5樓2012-08-28 21:30:51
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