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海尤希

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[交流] 重疊PCR中出現(xiàn)大量非特異性條帶

最近在做三個(gè)基因的重疊PCR，gene1：673bp gene2：1310bp gene3：667bp 重疊片段為20bp 。引物設(shè)計(jì)如下（粗體部分為重疊片段）：
gene1p1：GCTGGGAATGAGCTACGGCTC
gene1p2：CAGCTCCAGCCTACACAATCGCTTTAGCGATACGCGGCAACAA
gene2p1：AGCGATTGTGTAGGCTGGAGC
gene2p2：TTTCTGCTGGAATGAAGACCGTTTTCCGGGGATCCGTCGACCT
gene3p1：AACGGTCTTCATTCCAGCAG
gene3p2：GCAACGACCAATCGGACCAT
模版是通過(guò)高保真酶PCR并且切膠回收。起初將三基因放入同一體系中PCR，前15循環(huán)不加引物（退火56℃  l min 延伸72℃  2min50s  )后30個(gè)循環(huán)加gene1p1、gene3p2（退火54℃  l min 延伸72℃  3 min30s ）沒(méi)有成功，后嘗試先兩兩連接。

此次都是將模版與引物同時(shí)加入
gene1+gene2、與gene2+gene3的PCR條件均為
94℃  5min
94℃  40s
53℃  lmin
72℃  2min30s 30個(gè)循環(huán)
72℃  18min

電泳驗(yàn)證如”圖片1“ 1 為gene1+gene2 2為gene2+gene3
感覺(jué)在1882bp附近的是目的條帶，但底下的非特異性條帶也太亮了吧。
將目的條帶切膠回收之后又PCR，目的條帶依舊不明顯，下面的非特異性條帶依舊很亮。（PCR都是熱啟動(dòng)的）

我每次所加的模版比例是按照跑膠后的亮度估摸著加的，沒(méi)有進(jìn)攻嚴(yán)格的軟件分析，是否會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)有影響。

非常希望得到大家的幫助�。。。�！

圖片1.png

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1樓 2012-08-31 13:03:39

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加油小小帥

禁蟲(chóng)

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5樓2021-01-21 15:25:03

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王禮鵬

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可能的原因：1.引物特異性差2.模板或引物濃度過(guò)高3.Mg2+濃度偏高4.退火溫度偏低5.循環(huán)次數(shù)過(guò)多

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2樓2012-08-31 20:39:34

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海尤希

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引用回帖:

2樓: Originally posted by 王禮鵬 at 2012-08-31 20:39:34
可能的原因：1.引物特異性差2.模板或引物濃度過(guò)高3.Mg2+濃度偏高4.退火溫度偏低5.循環(huán)次數(shù)過(guò)多

mg2+在buffer里面買來(lái)時(shí)就已經(jīng)加好的，想問(wèn)下循環(huán)次數(shù)過(guò)多了嗎？那樣會(huì)有什么影響呢？

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3樓2012-09-01 22:50:09

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日光海

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我目前也是這樣，我是上下游同源臂各160bp左右，中間2700bp。也是鏈接產(chǎn)物太淡了，下面的非特異性條帶特別亮。我目前準(zhǔn)備換引物后在做做看。

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4樓2015-08-20 15:48:08

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